论文部分内容阅读
[研究目的] PI-103是一种人工合成的小分子磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)双抑制剂，通过研究PI-103对卵巢癌细胞增殖、侵袭等恶性表型的调控，以及PI-103抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路后对卵巢癌FASN表达水平的影响，探讨PI3K/Akt/mTOR信号通路与FASN之间的关系，为临床卵巢癌诊治以及选择性靶向药物应用提供新的实验研究依据。 [研究方法] 1.MTT法检测不同浓度的PI-103（0.125、0.25、0.5、1.0、2.0及4.0μmol/L）处理24h、48h、72h后卵巢癌细胞A2780的生长抑制情况，并根据公式计算出PI-103对细胞的抑制率，细胞生长抑制率=1-（实验组吸光度值-空白组吸光度值）/（对照组吸光度值-空白组吸光度值）。 2.平板克隆形成实验检测A2780细胞PI-103（2.0μmol/L）处理后与对照组的克隆形成细胞增殖的情况，并根据公式计算细胞克隆形成率，平板克隆形成率=平板克隆数/种板细胞数。Transwell实验检测A2780细胞PI-103(2.0μmol/L)作用24h内与对照组的细胞侵袭情况，并计数侵袭的细胞。 3.前期研究通过Western blotting方法检测实验室现有的A2780、SKOV3/DDP及SKOV3三种卵巢癌细胞中FASN的蛋白表达水平，筛选出FASN表达量最高的A2780卵巢癌细胞株进行药物干预后，再通过Western blotting方法检测比较A2780经PI-103处理前后FASN、p-Akt、p-rpS6、Akt、rpS6蛋白的表达水平，Image J软件检测蛋白条带灰度值，比较A2780细胞处理前后FASN、p-Akt、p-rpS6、Akt、rpS6蛋白的灰度值改变是否具有统计学意义，以了解PI-103对卵巢癌的影响以及FASN与PI3K/Akt/mTOR信号通路的抑制情况。 [研究结果] 1.PI-103能够抑制A2780细胞的生长。细胞的生长抑制率随着PI-103浓度的(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L)增加而逐渐增加(P＜0.05)。同时，随着作用时间延长（24h-48h-72h），增殖抑制的作用也显著增加(P＜0.05);当PI-103以2.0μmol/L处理A2780细胞72h时，细胞的抑制率接近50％; PI-103以4.0μmol/L处理A2780细胞72h，抑制作用最明显（P＜0.05）。 2.PI-103能够显著抑制A2780细胞的增殖及侵袭能力。平板克隆形成实验结果显示实验组的克隆形成率为(8.33±1.01)％，明显低于对照组((15.33±0.83)％)，提示PI-103对A2780卵巢癌细胞增殖具有抑制作用，两组差异具有统计学意义。Transwell侵袭实验结果显示对照组穿过上室的平均细胞数分别为156.33±4.04个，而实验组穿过细胞数为58.67±6.51个，两组差异有统计学意义。 3.PI-103能够显著抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路及FASN蛋白的表达。Image J软件检测蛋白条带灰度值，A2780、SKOV3/DDP及SKOV3三种细胞中FASN表达量相对于内参灰度值，A2780的表达量最高，为(58.02±3.25)％，SKOV3/DDP(46.99±5.43)％，SKOV3(37.97±2.78)％。实验组目的条带蛋白灰度值分别为对照组的FASN(63.05±6.45)％、p-Akt(70.53±5.47)％、p-rpS6(71.25±8.56)％、rpS6(95.76±3.54)％、Akt(102±7.83)％、β-actin(98.26±6.02)％。结果表明加入PI-103后FASN、磷酸化的Akt和rpS6蛋白表达量明显下降，而非磷酸化的Akt和rpS6表达无明显差异。 [结论] 1.一定浓度的PI-103在体外实验中可以显著抑制卵巢癌A2780细胞的生长、增殖、侵袭的能力。 2.PI-103在卵巢癌A2780细胞中可有效抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路中相关磷酸化蛋白质的表达(p-Akt、p-rpS6)，而非磷酸化状态的Akt、rpS6的表达无明显影响;同时显著抑制FASN的蛋白表达。 3.PI-103不仅对卵巢癌细胞PI3K/mTOR通路蛋白有抑制作用，同时对FASN调控的脂肪酸合成亦产生抑制作用。综合文献可知抑制FASN也可导致PI3K/mTOR通路的效应蛋白的抑制，但机制不甚明朗。本实验结果为深入了解FASN与PI3K/mTOR通路之间的关联提供了理论依据，也为临床上进一步研究卵巢癌的靶向治疗提供了实验依据。