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水稻是全球主要的粮食作物之一,是我国第二大粮食作物。而稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻三大病害之首,严重危害水稻生产,造成水稻大幅减产甚至绝产。稻瘟病菌主要通过产生分生孢子,随气流传播扩散到周围健康田块引发病害循环。水稻对稻瘟病菌的先天性防御机制大致分为两类:病原物相关分子模式触发免疫(PAMP-Triggered Immunity,PTI)和效应因子触发免疫(Effector-Triggered Immunity,ETI)。PTI 是由细胞外膜受体(plasma membrane receptors,PRRs)识别微生物保守性表位抗原PAMP分子而触发,构成植物对病原物的第一层防线,诱导诸如MAPK蛋白激酶级联,导致活性氧(ROS)积累与胼胝质沉积等防卫反应的发生。ETI由植物抗性基因(Resistence,R)特异识别病原物无毒基因(Avirulence,Avr)而诱发,是植物对病原物的第二道防线。已知水稻有100多种R基因,其中20多种已被克隆,且五对R基因与Avr基因功能研究较为透彻:Avr-Pita对Pita、Avr-Pik 对 Pik、AvrPiz-t 对 Piz-t、Avr-Pia 对 Pia 和 Avr-CO39 对 Pi-CO39。关于水稻与稻瘟病的研究主要集中在两方面:稻瘟病菌致病机理和水稻免疫机制。本文主要涉及水稻对稻瘟病菌的防卫反应。RNA沉默是植物中的保守免疫机制,可以通过植物细胞中产生的内源miRNAs调控植物的基因表达。RNA沉默依赖于AGOs(Argonaute proteins)蛋白家族:植物AGOs蛋白与miRNAs结合形成RNA诱导的沉默复合体(RISC),对植物中特异的mRNA切割或抑制其翻译。已有实验证明AGO2在拟南芥中可以特异性结合miR393’,参与拟南芥对细菌的防御反应。同时AGO2也与水稻的生殖发育密切相关。AGO18在水稻中可以识别miR168,从而阻止AGO1的下降,增强水稻抗病毒能力,由此推断AGO18参与水稻抗病毒反应。结合实验室前期实验结果,推测OsAGO2与OsAGO18参与水稻对稻瘟病的抗病防卫反应。本实验利用T-DNA插入获取不同的osagos突变体,筛选出单一插入位点的纯合突变体 9种(osago 1d、osago2、osago3、osago 11、osago 12、osago 14、osago 15、osago 17、osago18)。分别接种三种稻瘟病菌(Guy11、JS153、98-06)并观察其与野生型相比的表型变化。实验发现与野生型日本晴(Nipponbare,NPB)相比,osago2、osaO18突变体接种亲和型病原菌Guy11后表现为显著的抗病,接种非亲合型病原菌JS153均表现为明显的感病。水稻叶鞘注射实验进一步证明,Guy11侵染osago2突变体与侵染野生型NPB相比菌丝扩展受到抑制,JS153侵染osago2突变体与侵染野生型NPB相比菌丝扩展增多。初步推测水稻突变体osago2和osago18影响水稻中R基因对稻瘟病菌Avr基因的识别。后续,本研究用Guy11、JS153侵染 osago2、osago18突变体,取0h、144h样品,qRT-PCR检测侵染前后突变体与野生型中防卫基因表达的变化情况。Guy11侵染后,Oh与144 h,osago2中OsLOX、OsPAD4、OsWRKY53基因与NPB相比显著上调表达。表明与NPB相比,osago2对Guy11表现抗病的过程可能涉及SA、JA信号通路和PTI反应。JS153侵染后,0 h与144 h,osago2中OsAOS2、OsLOX、OsWRKY53基因与NPB相比显著下调表达,表明osago2对JS153表现感病的过程可能涉及JA信号通路和PTI反应。Guy11侵染,0 h与144 h,osago18中OsRGA4基因与NPB相比显著下调表达。表明osago18对Guy11表现抗病的过程可能涉及ETI反应。JS153侵染后,0h与144h相比,与NPB相比,osago18中OsLOX和OsRGA4基因显著下调表达,表明与NPB相比,osago18对JS153表现感病的过程可能涉及JA信号通路和PTI反应。此外,本实验在拟南芥中检测了 AR156生防菌激活拟南芥系统获得性抗性(SAR),从而增强拟南芥对细菌的抗性。为了明确AR156是否影响不同的激素信号传导通路,我们使用了有关植物材料进行了鉴定:拟南芥转基因系NahG和突变体npr1都不能发生SAR。AR156处理后,与野生型相比,jar1和ein2突变体叶片上出现类似的中度细菌性斑点。相反,NahG和npr1在这两种处理下显示无显著差异。细菌生长测定结果显示,与空白处理的植株相比,用AR156预处理的jar1和ein2突变体中Pst(EV)积累量明显减少,在NahG和npr1中Pst(EV)积累量无明显差别,说明AR156可以诱导拟南芥对Pst DC3000产生SAR,增强其防卫能力,并且AR156介导的SAR是依赖于SA信号通路和NPR1的。已知AR156可以通过抑制miR825和miR825*产生ISR并激活抗病相关基因,从而增强拟南芥对细菌的抗性。我们用两种稻瘟病菌(Guy11和JS153)分别侵染AR156和空白对照分别预处理的osago2和osago18,观察表型变化。病斑统计结果显示,Guy11侵染条件下,AR156预处理的NPB和osago18可能提高NPB和osago18对稻瘟病菌Guy11的抗性;JS153侵染下,AR156预处理的osago18可能提高osago18对稻瘟病菌JS153的抗性。对于OsAGO2和OsAGO18参与AR156介导的植物抗病性所涉及的信号通路,后期我们将进行进一步研究。