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[目的]A型核纤层蛋白前体(prelaminA)加工成熟出现异常则导致儿童早老症(HGPS)的出现,HGPS患者中细胞胞核结构和功能出现不同程度的异常,包括特征性的核畸形、DNA损伤加重、某些核蛋白表达下调等。在正常衰老的老年个体皮肤成纤维细胞中也发现有类似于HGPS患者细胞胞核畸变的现象。推测prelamin A及其相互作用蛋白在HGPS患者和人体生理性衰老过程中均发挥着重要作用。RanBPM(RanBP9,Ran Binding Protein in the Microtubule-OrganizingCenter)因在中心体参与微管的成核过程而命名,在哺乳动物组织中广泛表达而又高度保守,参与微管的动态变化、细胞迁移、核运动以及染色体的分离、蛋白与蛋白之间的相互作用等。本实验室前期工作通过酵母双杂交技术初步证明RanBPM是一个与prelamin A相互作用的蛋白,本研究进一步通过细胞外蛋白沉降实验(GST pull-down analysis)、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)实验及细胞内定位等方法证明其与prelamin A在细胞内外的相互作用,并初步探讨该蛋白在细胞衰老中的作用。
[方法]构建原核表达载体pET-32a-RanBPM,分别进行RanBPM和prelaminA的原核表达,通过GST pull-down实验证明两者在体外的相互作用;构建真核表达载体pEGFP-N1-RanBPM,将pCMV-myc-PLA和pEGFP-N1-RanBPM质粒共转染HEK-293细胞,进行免疫共沉淀实验。将构建的pEGFP-N1-RanBPM和pDsRedl-N1-prelamin A融合表达质粒转染人胚肾细胞293(HEK-293),荧光显微镜下观察RanBPM与prelamin A共定位情况。采用RT-PCR等方法检测RanBPM在HEK-293和HEK-293PLA细胞中mRNA转录水平,从而初步探讨RanBPM在衰老细胞中的作用。
[结果]成功构建原核表达载体pET-32a-RanBPM,通过GST pull-down实验验证了RanBPM和prelamin A在细胞外有相互作用;成功构建真核表达载体pEGFP-N1-RanBPM,通过免疫共沉淀实验,进一步证明了RanBPM和prelaminA在HEK-293细胞内有相互作用:细胞定位观察结果表明RanBPM在细胞胞核和胞浆均有表达,与prelamin A在HEK-293细胞核膜上共定位。PCR结果显示RanBPM在HEK-293PLA细胞中mRNA转录水平较HEK-293细胞轻度下降。
[结论]RanBPM和prelamin A在细胞内外均有相互作用,两者能共定位于HEK-293细胞核膜。RanBPM在衰老表型细胞HEK-293PLA中mRNA转录水平轻度下降,提示该蛋白的表达可能与细胞衰老相关。