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具有双向分化潜能和较强增殖能力的肝脏前体细胞(hepatic progenitor cells)正成为肝脏疾病治疗的一种值得期待的选择。而明确体外培养肝脏前体细胞的分化特性,建立优化的诱导分化程序也随之成为肝脏前体细胞研究的关键环节。在前期研究中,我们利用甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)启动子序列调控增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)基因表达的载体系统,从原代培养人胚胎肝脏细胞群体中,成功筛选、鉴定及扩增获得了特征均一、高表达AFP的肝脏前体细胞,即人胚胎肝脏前体细胞(human fetal hepatic progenitor cells,hFHPCs)。
本课题以hFHPCs为研究对象,分析不同细胞外信号分子,细胞外基质单独或联合处理对hFHPCs定向成熟肝实质细胞方向分化的诱导作用,旨在建立体外条件下获得具有成熟功能肝实质细胞的诱导体系;并研究hFHPCs在体外诱导体系中肝实质细胞极性的建立。主要研究结果如下:
1.hFHPCs经多因子联合诱导后可获得成熟肝实质细胞的部分功能
hFHPCs在制瘤素M(oncostatin M,OSM)、地塞米松(dexamethasone,DEX)和肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF),简称ODH,联合诱导7天后,Real-timeRT-PCR结果显示,白蛋白(albumin,ALB)mRNA表达明显增加,AFP-mRNA表达显著降低,两者变化均具有时间依赖性;免疫组化结果显示:诱导后细胞内AFP蛋白表达降低,ALB表达增加,细胞角蛋白8(cytokeratin8,CK8)表达增加,可见双核细胞,同时α-抗胰蛋白酶(α-antitrypsin,AAT)呈弱阳性表达。诱导后,细胞分泌ALB量逐渐增加,代谢氨合成尿素的能力逐渐增强,具有较强的糖原合成能力和CYP281/2酶活性。上述结果说明:ODH联合诱导能促进hFHPCs向成熟肝实质细胞方向分化。
2.hFHPCs在HGF预处理5天、ODH诱导5天后获得成熟肝实质细胞的极性
相差显微镜观察显示:hFHPCs(Day0)呈小细胞上皮样形态,经HGF预处理5(Day5)天,ODH继续作用5天(Day10)后,细胞体积变大,形态呈立方形,排列紧凑,可见多个双核细胞,即呈肝实质细胞样细胞(hepatocyte-likecells,HLCs)。
免疫细胞化学染色显示,Day0期细胞紧密连接的标志蛋白ZO-1阳性部位出现在胞浆,呈点状分布。Day5期,ZO-1蛋白开始出现在细胞与细胞之间。Day10期,ZO-1的表达定位于细胞与细胞之间,呈线状,且在共聚焦显微镜下观察到与纤维状肌动蛋白丝(filamentactin,F-actin)共定位。
跨上皮膜电阻(transepithelialelectricresistance,TER)测定的结果显示,Day5期TER值与Day0期相比,数值增高且具有统计学意义;Day10期TER值明显高于Day5期,P<0.05,说明诱导后细胞间逐渐形成功能性紧密连接。
分析细胞代谢CDFDA的能力发现:诱导各期细胞内均能将CDFDA水解成CDF,而后者在荧光激发下可发出绿色荧光,Day0期CDF仅存在于细胞内;Day5期CDF开始出现在细胞顶端,但仍未分泌到细胞外;Day10期CDF出现在细胞间隙,说明Day10期细胞间形成类胆管样结构。
免疫细胞化学染色分析细胞内骨架的变化发现:F-aetin在Day0期细胞内呈密布网状,Day5期开始在细胞边缘聚集,至Day10期时已围绕细胞轮廓形成的F-actin束;β-微管蛋白(β-tubulin)在Day0期细胞内均匀分布,Day5期β-tubulin随细胞走形分布,至Day10期β-tubulin呈丝状,且在细胞核一侧富集。CK8在Day0期细胞仅有少数表达,且较弱,Day5期细胞内CK8开始表达增强,Day10期大多数细胞表达明显强,且聚集在细胞边缘。细胞粘附连接相关蛋白(Vinculin)的表达也发生了相应变化,主要由hFHPCs均匀分布于细胞贴壁面变为HLCs中主要位于细胞贴壁面边缘。上述结果说明:hFHPCs在HGF预处理5天、ODH诱导5天后的HLCs获得成熟肝实质细胞的极性。
3.包被细胞外基质(extraeellularmatrix,ECM)使HLCs获得的肝实质细胞
极性更完善
将hFHPCs接种在包被基质胶(Matrigel)或Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)的培养皿上,HGF预处理5天、ODH诱导5天后,经免疫细胞化学染色发现,HLCs能表达肝实质细胞顶膜面标志性蛋白二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidylpeptidaseⅣ,DPPⅣ);相对于未包被组,包被Matrigel和CollagenⅠ的细胞内骨架蛋白β-tubulin在细胞核周围富集更明显,形成类微管组织中心(microtubuleorganizingcenter,MTOC);而包被ECM后细胞内CK8相对于未包被表达明显增强,分布均匀;Vinculin在包被后主要定位于细胞与细胞之间的位置,排列成线状,环绕细胞轮廓。
综上所述,本研究证实:OSM,DEX及HGF组合能有效促进hFHPCs的成熟分化;HGF预处理5天,再用ODH作用能促进分化后的肝实质样细胞形成极性;包被ECM使HGF预处理,ODH诱导hFHPCs建立的肝实质细胞极性更加完善。
结论
细胞因子和ECM共同参与了体外人胚胎肝脏前体细胞成熟分化及肝实质细胞极性的建立。本研究为阐明肝脏前体细胞的分化特性提供了一定的实验依据,对于进一步分析调控hFHPCs的分化机制打下扎实的实验基础。