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围术期脑缺血再灌注损伤一直是临床麻醉与复苏所关注的问题。据国外报道，成人体外循环下心内直视手术后第一周内，细微的神经功能异常或精神损伤发生率可高达53％，6个月后部分病人得到改善，但24％的病人仍遗留精神行为减退，其中42％病人甚至持续5年之久。缺血再灌注中神经细胞损伤是一个多因素、多环节、多途径的过程，其分子机制迄今尚未完全阐明。 临床中川芎嗪常用于缺血性脑血管疾病及其后遗症的治疗，然而，我们对其作用机制尚有不少分歧、争议。本研究拟在体外原代培养大鼠海马神经元细胞的基础上，探讨川芎嗪对缺氧/复氧大鼠海马神经元的影响，试图通过本研究，从细胞、分子水平上阐明川芎嗪脑保护作用机制，为川芎嗪脑保护的方法在临床上的应用开创新的思路，提供理论依据，减轻社会和经济负担。 研究目的： 1．观察川芎嗪对体外培养大鼠海马神经元形态和细胞活力的影响，初步了解川芎嗪对海马神经细胞的干预作用。 2．观察川芎嗪对缺氧/复氧大鼠海马神经元的保护作用，并探讨其作用机理。 研究方法： 1.体外培养大鼠海马神经元，培养第7-9天，光学显微镜和免疫细胞化学染色鉴定神经元。 2.分别将含川芎嗪30、60、90、200、800、1000μg/ml的培养液加入培养至7-9天的大鼠海马神经元中，与海马神经元共培养24小时，观察川芎嗪对其形态学和细胞活力的影响。 3.实验分组及缺氧/复氧模型的建立 以培养7-9天的胎鼠海马神经元为研究对象，随机分为5组：L组(TMP低浓度组60ug/ml)，M组（TMP中浓度组200ug/ml），H组（TMP高浓度组800ug/ml），C组（对照组0ug/ml），N组（正常组）。除正常组外分别加入相应浓度的川芎嗪，作用1小时后放入90%N2+10%CO2培养箱中作用2小时诱导缺氧，然后放入5%CO2培养箱中复氧。 4.培养7-9天的胎鼠海马神经元缺氧/复氧损伤后，MTT法检测细胞活力，倒置显微镜观察细胞形态学变化，透射电镜观察细胞超微结构变化，分光光度计检测培养上清中MDA、SOD、LDH的含量，流式细胞仪检测神经元凋亡率，免疫细胞化学检测即早基因C-fos蛋白和热休克蛋白（HSP70）的表达。 研究结果： 1.相差显微镜下培养至7-9天的大鼠海马神经元细胞胞体呈锥形或多角形，突起主干和分支明显延长并增粗，有明显光晕，折光性强，富有立体感，形成稠密的网络结构，细胞免疫组化结构显示，大部分细胞可见神经元烯醇酶（neuron specific enolase， NSE）免疫阳性颗粒位于神经细胞核周质及核突起中（呈棕黄色），细胞核不染色，为一圆形或椭圆形淡然区，此类细胞为神经元；少量细胞呈弱阳性，该类细胞为胶质细胞。透射电镜可见其神经元体积较大，细胞核、细胞质均较大，呈浅灰色着色，染色质分布均匀，核膜双层结构完整，线粒体、溶酶体、内质网等细胞器较丰富。 2．川芎嗪与与大鼠海马神经元共培养24h，与正常对照组（0μg/ml）相比，30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml、800μg/ml川芎嗪组形态学上无明显变化；200μg/ml川芎嗪组神经元胞体较大，突起密集；1000μg/ml川芎嗪细胞变圆、皱缩，折光性下降，部分突起收缩。 3．缺氧/复氧损伤后，海马神经细胞折光性下降，部分细胞变圆、皱缩、脱落，裂解成碎片，透射电镜显示胞核呈圆形，核膜光滑，染色质边集，线粒体肿胀、部分内质网扩张，或线粒体嵴断裂、模糊或消失，粗面内质网数量减少、排列紊乱。60、200、800ug/ml川芎嗪预给药1h，能不同程度的减轻缺氧/复氧对大鼠海马神经元的损伤，光镜下细胞形态无明显改变，透射电镜下可见200μg/ml组除少量染色质边聚、内质网轻度扩张、线粒体轻微肿胀外，余与正常的海马神经元细胞无明显差异。 4．缺氧/复氧损伤后川芎嗪60μg/ml、200μg/ml、800μg/ml预给药组细胞活力、MDA、SOD、LDH的含量分别为（0.59±0.09、0.72±0.04、0.60±0.07）、（3.75±0.26、2.43±0.86、3.45±0.47）nmol/ml、（30.76±4.28、41.53±3.28、33.54±5.07）U/ml、（623.71±102.83、276.63±75.59、537.80±109.18）U/L，与单纯缺氧/复氧有显著性差异（P＜0.05）。川芎嗪200μg/ml组较60μg/ml、800μg/ml组差异亦有显著性。 5．与单纯缺氧/复氧组比较，川芎嗪60μg/ml、200μg/ml、800μg/ml预给药均可不同程度降低海马神经细胞的凋亡率（P＜0.01）、降低C-fos蛋白的表达（P＜0.01）、促进HSP70蛋白的表达（P＜0.05）。川芎嗪200μg/ml组差异最为显著。 研究结论： 1．本实验建立的胎鼠海马神经元培养方法，可得到纯度较高的神经元，为揭示神经元、神经网络超微结构及神经元生理、生化和病理等方面的复杂变化和研究神经药理提供了便利。 2．一定浓度的川芎嗪对正常培养的大鼠海马神经元有促进作用，其神经元胞体较大，突起密集。 3．川芎嗪60μg/ml、200μg/ml、800μg/ml预给药均可不同程度降低缺氧/复氧诱导海马神经细胞的凋亡和坏死，抑制LDH的漏出、减少MDA的产生、促进SOD的生成；同时可抑制即早基因 C-fos蛋白的表达，促进热休克蛋白（HSP70）的表达。该作用具有剂量相关性，高、中、低三种浓度的川芎嗪均有保护作用，200μg/ml浓度的川芎嗪保护作用最显著。