论文部分内容阅读
原发性肺癌的发病率和死亡率居全球恶性肿瘤谱第一位，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占其中的80～85％,一直是临床和科研关注的热点疾病。目前NSCLC治疗模式包括传统的手术、放疗、化疗以及分子靶向治疗和免疫治疗等。由于很多初诊患者就诊时己处于进展期或已经出现转移，5年生存率仅维持在10％-20％,即使早期可切除NSCLC的五年生存率也只有60％-70％。复发和转移是其死亡的主要原因。因此，如何控制肿瘤细胞的侵袭转移，以进一步提高NSCLC的治疗效果、延长患者的生存时间至关重要。肿瘤的侵袭转移是一个多因素、多步骤的生物过程，其中肿瘤细胞的增殖和侵袭迁移能力的增强是肿瘤进展的关键环节。
转录因子可以调控靶基因的表达，进而影响细胞或器官的发育、分化以及代谢等生物学过程。FOX(fork head box，FOX)超家族以高度保守的特征性叉头框DNA结构域为标志，迄今为止，人类中已经鉴定出50个FOX基因，并分为19个亚组(FOXA-FOXS)。FOX家族成员在新陈代谢、分化、增殖、发育、凋亡以及肿瘤的增殖、迁移侵袭和耐药性等过程中都发挥有非常重要的作用。作为FOX转录因子家族中的一员，FOXC1（forkhead box c1，FOXC1）可通过自身所特有的叉头区这一DNA(Deoxyribonucleic acid，DNA)结构域与目的基因的结合启动转录，表达某些特定蛋白。最初研究发现FOXC1是胚胎发育过程中的重要转录因子，能够调控细胞增殖及分化，参与大脑、眼睛、心脏等器官的发育过程。最近几年的研究发现，FOXC1基因突变不但与胚胎发育异常密切相关，还参与了肿瘤的发生发展过程。已发表的研究主要集中在FOXC1与乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌发生发展的关系，发现FOXC1在肿瘤的预后判断中可能存在价值，甚至可能为肿瘤治疗提供新的靶点。关于FOXC1在肿瘤细胞中高表达的分子作用目前主要集中在FOXC1促进BLBC(basal-like breast cancer,BLBC)的侵袭转移机制方面的实验研究，包括调控内皮间皮转化（Epithelial-mesenchymal trandsifion，EMT），促进MMP7(Matrix metalloproteinase7，MMP7)的表达及激活NF-κB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)途径等。而FOXC1在NSCLC中的作用及其机制少有报道。
本实验中，明确FOXC1在NSCLC进展中的作用后，通过全基因组基因芯片分析FOXCI介导的基因变化及Go分析探讨其介导的生物学过程，综合生物信息软件在线预测筛选出基因差异最明显且文献报道证实在进展期肺癌表达上调的转移侵袭相关基因赖氨酰氨基转移酶(Lysyl oxidase，LOX)。
LOX是铜依赖的赖氨酰氧化酶家族中的典型成员，可以在细胞外基质中氧化胶原蛋白、弹性蛋白上的氨基酸残基，并使两者之间形成共价交联。这种交联可以维持正常结缔组织功能、胚胎发育以及创伤愈合。这种交联结构还能让组织胶原纤维连接更加紧密，细胞外基质稳定性增强，抵抗胶原酶的水解。因此，LOX表达异常或者活性改变都会导致疾病的出现。最近大量的研究表明LOX异常表达参与了肿瘤的发生发展、肿瘤细胞的分化、增殖、黏附性、恶性转化和侵袭性等过程。在May-Lin Wilgus等人的研究中，LOX蛋白在肺腺癌中的表达明显升高，而且与Ⅰ期腺癌患者五年生存率呈负相关。LOX在肿瘤细胞中的表达，可以作为判断早期肺腺癌患者侵袭以及评估临床预后的标志物。通过靶向干扰LOX表达或者抑制LOX活性可抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，而且LOX中和抗体在许多临床前实验显示出了令人振奋的结果。在Xiaoying Hou等的研究表明:LOX的表达与肺腺癌的不良预后相关，并且可以通过水飞蓟宾调控LOX/EGFR表达抑制NSCLC的转移。
因此，我们设计了本次实验。第一部分主要检测FOXC1在NSCLC组织中的表达以及FOXC1对NSCLC细胞生物学能力的影响。第二部分主要研究LOX在FOXC1介导的NSCLC细胞侵袭和转移中的作用。并通过双荧光素酶和CHIP实验证实FOXC1可以通过直接与LOX启动子结合促进NSCLC的侵袭和迁移，初步探讨了FOXC1参与NSCLC进展的分子机制。FOXC1/LOX轴参与FOXC1介导的NSCLC细胞恶性生物学行为，靶向干扰FOXC1或LOX的表达均可为临床治疗提供理论依据。
研究目的：
为探讨FOXC1在NSCLC发生发展过程中的作用，我们首先检测FOXC1在NSCLC组织中的表达，明确FOXC1在NSCLC组织及对照组织中的表达情况及与临床预后的关系;然后通过表达或干扰NSCLC细胞中的FOXC1表达，检测FOXC1对NSCLC细胞增殖、侵袭、迁移等恶性生物学能力的影响，并在裸鼠皮下移植瘤模型和尾静脉注射转移模型中进一步验证。最后通过表达谱基因芯片分析，明确FOXC1促进肿瘤进展的可能分子机制，为FOXC1在NSCLC的治疗中的潜在价值提供理论基础。
研究方法：
1.通过免疫组化检测FOXC1在肿瘤组织及对照组织中的表达;根据IHC染色评分结果，统计分析FOXC1表达水平与NSCLC患者临床病理学特征之间的关系;整理NSCLC患者的随访资料，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，应用log-rank法分析FOXC1的表达与NSCLC患者生存时间之间的关系。
2.通过PCR及Western blot检测FOXC1基因在NSCLC细胞株中的表达，筛选出内源性高表达FOXC1的细胞株和低表达FOXC1的细胞株。选择FOXC1低表达的细胞株H1299和H1650转染FOXC1质粒上调FOXC1表达，并通过转染慢病毒构建稳定过表达FOXC1的细胞株;选择FOXC1高表达的细胞株A549和H226转染shFOXC1干扰FOXC1表达，并通过转染慢病毒构建稳定干扰FOXC1表达的细胞株。
3.通过CCK-8生长曲线以及平板克隆实验，观察FOXC1对NSCLC细胞增殖能力的影响;通过划痕实验和Transwell小室迁移和侵袭实验，检测FOXC1对NSCLC细胞侵袭迁移能力的影响。
研究结果:
1.FOXC1在原发性NSCLC肿瘤细胞中高表达且与临床预后不良相关
免疫组化结果显示:FOXC1主要表达在肿瘤细胞的细胞质和细胞核，染色为棕黄甚至褐色颗粒。FOXC1在原发性NSCLC组织肿瘤细胞中高表达，在肿瘤周围对照组织中表达很低。在105例原发性NSCLC组织标本中，FOXC1的阳性表达率为56.19％(59/105)，而在正常组织中阳性率仅为22.5％(9/40)，两者有统计学差异(P＜0.01)。FOXC1的表达与肿瘤类型(p=0.011)、区域淋巴结分级(p=0.005)等临床病理参数呈正相关，而与年龄(p=0.722)、吸烟史(p=0.537)、细胞不良分化(p=0.192)、及TNM分期(p=0.474)无明显正相关。FOXC1在Ⅱ+Ⅲ期患者中的表达(61.8％)明显升高，但不具有统计学意义(P=0.059)。
生存分析结果显示:与FOXC1低表达组患者相比，FOXC1高表达组的患者生存时间明显缩短(P=0.0472)。单变量回归分析显示:FOXC1高表达(P=0.009)、TNM分期(T2+T3，P=0.042)，淋巴结转移(P=0.009)及临床分期(Ⅱ+Ⅲ，P=0.02)与NSCLC患者的总生存期密切相关。多因素分析显示:只有FOXC1高表达(P=0.043)可作为NSCLC患者的独立预后因子(hazard ratio，1.988，95％confidence interval，1.022-3.860)。
2.FOXC1促进NSCLC细胞的体外增殖、侵袭和迁移能力
qRT-PCR及Western blot检测结果显示:FOXC1在本实验中所用5株NSCLC细胞株(A549、H226、H1299、H1650及H1975)中均有表达，其中H1650及H1299表达最低，A549及H226表达最高。
3.FOXC1促进NSCLC细胞体内成瘤及转移
首先构建FOXC1过表达细胞株H1299-FOXC1及对照组H1299-MOCK，然后建立皮下移植瘤模型观察转染细胞的体内成瘤能力，结果显示:BALB/c Nude裸鼠种植H1299-FOXC1细胞组，肿瘤体积显著大于H1299-MOCK细胞组;肿瘤重量与肿瘤体积趋势一致，差异有统计学意义。最后通过尾静脉注射建立肿瘤转移模型，结果显示:尾静脉注射H1299-FOXC1细胞组裸鼠，肺部转移灶数目比尾静脉注射H1299-MOCK细胞组多;经组织切片、HE染色后观察，H1299-FOXC1组肺组织中可靠观察到相应的肿瘤转移灶。
研究结论:
1.FOXC1在NSCLC组织中高表达且与临床不良预后相关。
2.体外细胞实验表明FOXC1可促进NSCLC细胞增殖、侵袭及迁移等生物学行为。
3.体内动物实验表明FOXC1可促进NSCLC细胞体内成瘤及转移。
4.FOXC1可通过直接与LOX启动子结合调节其表达，进而影响肿瘤侵袭和迁移过程，最终促进肿瘤进展。
转录因子可以调控靶基因的表达，进而影响细胞或器官的发育、分化以及代谢等生物学过程。FOX(fork head box，FOX)超家族以高度保守的特征性叉头框DNA结构域为标志，迄今为止，人类中已经鉴定出50个FOX基因，并分为19个亚组(FOXA-FOXS)。FOX家族成员在新陈代谢、分化、增殖、发育、凋亡以及肿瘤的增殖、迁移侵袭和耐药性等过程中都发挥有非常重要的作用。作为FOX转录因子家族中的一员，FOXC1（forkhead box c1，FOXC1）可通过自身所特有的叉头区这一DNA(Deoxyribonucleic acid，DNA)结构域与目的基因的结合启动转录，表达某些特定蛋白。最初研究发现FOXC1是胚胎发育过程中的重要转录因子，能够调控细胞增殖及分化，参与大脑、眼睛、心脏等器官的发育过程。最近几年的研究发现，FOXC1基因突变不但与胚胎发育异常密切相关，还参与了肿瘤的发生发展过程。已发表的研究主要集中在FOXC1与乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌发生发展的关系，发现FOXC1在肿瘤的预后判断中可能存在价值，甚至可能为肿瘤治疗提供新的靶点。关于FOXC1在肿瘤细胞中高表达的分子作用目前主要集中在FOXC1促进BLBC(basal-like breast cancer,BLBC)的侵袭转移机制方面的实验研究，包括调控内皮间皮转化（Epithelial-mesenchymal trandsifion，EMT），促进MMP7(Matrix metalloproteinase7，MMP7)的表达及激活NF-κB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)途径等。而FOXC1在NSCLC中的作用及其机制少有报道。
本实验中，明确FOXC1在NSCLC进展中的作用后，通过全基因组基因芯片分析FOXCI介导的基因变化及Go分析探讨其介导的生物学过程，综合生物信息软件在线预测筛选出基因差异最明显且文献报道证实在进展期肺癌表达上调的转移侵袭相关基因赖氨酰氨基转移酶(Lysyl oxidase，LOX)。
LOX是铜依赖的赖氨酰氧化酶家族中的典型成员，可以在细胞外基质中氧化胶原蛋白、弹性蛋白上的氨基酸残基，并使两者之间形成共价交联。这种交联可以维持正常结缔组织功能、胚胎发育以及创伤愈合。这种交联结构还能让组织胶原纤维连接更加紧密，细胞外基质稳定性增强，抵抗胶原酶的水解。因此，LOX表达异常或者活性改变都会导致疾病的出现。最近大量的研究表明LOX异常表达参与了肿瘤的发生发展、肿瘤细胞的分化、增殖、黏附性、恶性转化和侵袭性等过程。在May-Lin Wilgus等人的研究中，LOX蛋白在肺腺癌中的表达明显升高，而且与Ⅰ期腺癌患者五年生存率呈负相关。LOX在肿瘤细胞中的表达，可以作为判断早期肺腺癌患者侵袭以及评估临床预后的标志物。通过靶向干扰LOX表达或者抑制LOX活性可抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，而且LOX中和抗体在许多临床前实验显示出了令人振奋的结果。在Xiaoying Hou等的研究表明:LOX的表达与肺腺癌的不良预后相关，并且可以通过水飞蓟宾调控LOX/EGFR表达抑制NSCLC的转移。
因此，我们设计了本次实验。第一部分主要检测FOXC1在NSCLC组织中的表达以及FOXC1对NSCLC细胞生物学能力的影响。第二部分主要研究LOX在FOXC1介导的NSCLC细胞侵袭和转移中的作用。并通过双荧光素酶和CHIP实验证实FOXC1可以通过直接与LOX启动子结合促进NSCLC的侵袭和迁移，初步探讨了FOXC1参与NSCLC进展的分子机制。FOXC1/LOX轴参与FOXC1介导的NSCLC细胞恶性生物学行为，靶向干扰FOXC1或LOX的表达均可为临床治疗提供理论依据。
研究目的：
为探讨FOXC1在NSCLC发生发展过程中的作用，我们首先检测FOXC1在NSCLC组织中的表达，明确FOXC1在NSCLC组织及对照组织中的表达情况及与临床预后的关系;然后通过表达或干扰NSCLC细胞中的FOXC1表达，检测FOXC1对NSCLC细胞增殖、侵袭、迁移等恶性生物学能力的影响，并在裸鼠皮下移植瘤模型和尾静脉注射转移模型中进一步验证。最后通过表达谱基因芯片分析，明确FOXC1促进肿瘤进展的可能分子机制，为FOXC1在NSCLC的治疗中的潜在价值提供理论基础。
研究方法：
1.通过免疫组化检测FOXC1在肿瘤组织及对照组织中的表达;根据IHC染色评分结果，统计分析FOXC1表达水平与NSCLC患者临床病理学特征之间的关系;整理NSCLC患者的随访资料，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，应用log-rank法分析FOXC1的表达与NSCLC患者生存时间之间的关系。
2.通过PCR及Western blot检测FOXC1基因在NSCLC细胞株中的表达，筛选出内源性高表达FOXC1的细胞株和低表达FOXC1的细胞株。选择FOXC1低表达的细胞株H1299和H1650转染FOXC1质粒上调FOXC1表达，并通过转染慢病毒构建稳定过表达FOXC1的细胞株;选择FOXC1高表达的细胞株A549和H226转染shFOXC1干扰FOXC1表达，并通过转染慢病毒构建稳定干扰FOXC1表达的细胞株。
3.通过CCK-8生长曲线以及平板克隆实验，观察FOXC1对NSCLC细胞增殖能力的影响;通过划痕实验和Transwell小室迁移和侵袭实验，检测FOXC1对NSCLC细胞侵袭迁移能力的影响。
研究结果:
1.FOXC1在原发性NSCLC肿瘤细胞中高表达且与临床预后不良相关
免疫组化结果显示:FOXC1主要表达在肿瘤细胞的细胞质和细胞核，染色为棕黄甚至褐色颗粒。FOXC1在原发性NSCLC组织肿瘤细胞中高表达，在肿瘤周围对照组织中表达很低。在105例原发性NSCLC组织标本中，FOXC1的阳性表达率为56.19％(59/105)，而在正常组织中阳性率仅为22.5％(9/40)，两者有统计学差异(P＜0.01)。FOXC1的表达与肿瘤类型(p=0.011)、区域淋巴结分级(p=0.005)等临床病理参数呈正相关，而与年龄(p=0.722)、吸烟史(p=0.537)、细胞不良分化(p=0.192)、及TNM分期(p=0.474)无明显正相关。FOXC1在Ⅱ+Ⅲ期患者中的表达(61.8％)明显升高，但不具有统计学意义(P=0.059)。
生存分析结果显示:与FOXC1低表达组患者相比，FOXC1高表达组的患者生存时间明显缩短(P=0.0472)。单变量回归分析显示:FOXC1高表达(P=0.009)、TNM分期(T2+T3，P=0.042)，淋巴结转移(P=0.009)及临床分期(Ⅱ+Ⅲ，P=0.02)与NSCLC患者的总生存期密切相关。多因素分析显示:只有FOXC1高表达(P=0.043)可作为NSCLC患者的独立预后因子(hazard ratio，1.988，95％confidence interval，1.022-3.860)。
2.FOXC1促进NSCLC细胞的体外增殖、侵袭和迁移能力
qRT-PCR及Western blot检测结果显示:FOXC1在本实验中所用5株NSCLC细胞株(A549、H226、H1299、H1650及H1975)中均有表达，其中H1650及H1299表达最低，A549及H226表达最高。
3.FOXC1促进NSCLC细胞体内成瘤及转移
首先构建FOXC1过表达细胞株H1299-FOXC1及对照组H1299-MOCK，然后建立皮下移植瘤模型观察转染细胞的体内成瘤能力，结果显示:BALB/c Nude裸鼠种植H1299-FOXC1细胞组，肿瘤体积显著大于H1299-MOCK细胞组;肿瘤重量与肿瘤体积趋势一致，差异有统计学意义。最后通过尾静脉注射建立肿瘤转移模型，结果显示:尾静脉注射H1299-FOXC1细胞组裸鼠，肺部转移灶数目比尾静脉注射H1299-MOCK细胞组多;经组织切片、HE染色后观察，H1299-FOXC1组肺组织中可靠观察到相应的肿瘤转移灶。
研究结论:
1.FOXC1在NSCLC组织中高表达且与临床不良预后相关。
2.体外细胞实验表明FOXC1可促进NSCLC细胞增殖、侵袭及迁移等生物学行为。
3.体内动物实验表明FOXC1可促进NSCLC细胞体内成瘤及转移。
4.FOXC1可通过直接与LOX启动子结合调节其表达，进而影响肿瘤侵袭和迁移过程，最终促进肿瘤进展。