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肿瘤转移是导致恶性肿瘤患者生活质量下降和死亡的主要原因。因此，多年以来，有关肿瘤转移的研究者们进行了大量的研究，致力于揭示肿瘤转移的发生机制，寻找肿瘤转移的治疗策略。1889年，Stephen Paget提出“种子与土壤”学说来描述肿瘤转移的发生过程。Stephen Paget认为，具有转移潜能的肿瘤细胞（即种子）与肿瘤即将到达的靶器官的微环境（即土壤）相互作用，形成转移瘤。后来许多学者进行了大量的研究，提出相似结论，这一特殊的亲和现象已被公认。2005年，Rosandra Kaplan在Nature杂志上发表文章，提出了“pre-metastatic niche”的理论。该学说认为，在循环肿瘤细胞到达转移靶器官之前，原发肿瘤通过多种机制改变靶器官的微环境，使其适于肿瘤细胞定植和生长。这一预先改变的微环境，即预转移小生境(pre-metastatic niches)。从2005年至今，许多肿瘤学者进行了有关预转移小生境的研究，并总结了预转移小生境的六大特征。这六大特征分别是:免疫抑制(immunosupression);炎症反应(inflammation);血管生成/血管通透性升高(angiogenesis/vascular permeability);淋巴管生成(lymphangiogenesis);器官特异性（organotropism）和重编程(reprogramming)。其中，血管通透性升高被认为是预转移小生境形成的起始步骤。因此，研究和探讨血管通透性升高的发生机制有可能为肿瘤转移提供新的治疗思路。
本研究第一部分内容利用4T1乳腺癌肺转移模型验证了原发肿瘤分泌的VEGF导致预转移肺组织血管通透性升高以及紧密连接蛋白occludin下调。第二部分进一步探讨了VEGF引起occludin下调的机制。本研究旨在寻找在预转移小生境中VEGF诱导血管内皮通透性升高的潜在下游分子，从而为预防肺预转移小生境的形成提供治疗策略。
第一部分 原发肿瘤分泌的VEGF通过下调紧密连接蛋白occludin诱导预转移小生境中血管通透性升高
研究目的：
探讨原发肿瘤诱导预转移小生境中血管通透性升高的可能机制。
研究方法：
1.乳腺癌肺转移模型的建立:于6-8周龄的雌性Barb/c小鼠第四对乳腺原位注射4T1乳腺癌细胞，建立乳腺癌肺转移模型。
2.HE染色及肺组织干湿比计算观察预转移阶段原发乳腺癌对肺组织血管通透性的影响。
3.ELISA法检测荷瘤小鼠及4T1乳腺癌细胞培养基上清中细胞因子的表达。
4.血管通透性实验:BALB/c小鼠接种4T1细胞后第14天，尾静脉注射结合罗丹明B异硫氰酸酯的低分子葡聚糖(rhodamine-conjugated dextran，70 kD)，4h后尾静脉注射结合绿色荧光蛋白的凝集素(FITC-lectin)，30 min后进行心脏灌洗。灌洗完毕后解剖小鼠，留取肺组织，将肺组织制成冰冻切片，于显微镜下观察。
5.Western Blotting及免疫荧光观察原发乳腺癌对肺组织中紧密连接蛋白occludin表达的影响。
6.VEGF处理HUVECs，观察VEGF对血管内皮细胞通透性以及内皮细胞中紧密连接蛋白occludin含量的影响。
7.贝伐珠单抗处理HUVECs，观察贝伐珠单抗对VEGF诱导的血管内皮细胞通透性升高以及内皮细胞中紧密连接蛋白occludin下调的影响。
8.贝伐珠单抗处理荷瘤小鼠，观察贝伐珠单抗对原发肿瘤诱导的转移前肺组织血管通透性升高的影响。
9.将occludin过表达质粒转染进HUVECs，观察occludin对血管内皮细胞通透性的调节作用。
研究结果：
1.在预转移阶段，与对照组相比，荷瘤组小鼠肺组织肿胀，肺组织含水量增加。HE染色显示，建立原发乳腺癌模型之后，荷瘤组小鼠肺组织中出现炎症细胞浸润，并且随着肿瘤的生长，炎症反应逐渐加重。
2.动物实验证实，在预转移阶段，荷瘤小鼠肺组织血管通透性升高。
3.ELISA实验显示，在荷瘤小鼠血清及4T1乳腺癌细胞的培养基上清中，VEGF表达显著升高。
4.应用贝伐珠单抗处理小鼠，能够抑制原发肿瘤诱导的肺组织血管通透性升高。
5.Western Blotting及免疫荧光显示，原发乳腺癌能够诱导预转移阶段小鼠肺组织中紧密连接蛋白occludin表达下调。
6.在体外实验中，Western Blotting及免疫荧光显示，VEGF能够诱导血管内皮细胞通透性升高以及HUVECs中紧密连接蛋白occludin表达下调。
7.应用贝伐珠单抗处理HUVECs，能够降低VEGF诱导的血管内皮细胞通透性升高以及occludin表达下调。
8.过表达occludin能够部分阻断VEGF诱导的血管内皮细胞通透性的升高。
研究结论：
1.原发肿瘤分泌的VEGF诱导转移前期肺组织中血管通透性升高。
2.原发肿瘤分泌的VEGF通过诱导occludin表达下调导致血管通透性升高。
第二部分 原发肿瘤分泌的VEGF通过磷酸化-泛素化途径诱导紧密连接蛋白occludin表达下调
研究目的：
探讨VEGF诱导occludin表达下调的可能机制。
研究方法：
1.免疫荧光染色检测预转移阶段对照组和实验组小鼠肺组织中磷酸化occludin的表达。
2.Western Blotting检测VEGF处理HUVECs后紧密连接蛋白occludin第490位丝氨酸的磷酸化。
3.Co-IP检测VEGF处理HUVECs后occludin的泛素化。
4.将模拟occludin磷酸化的质粒S490D转染入HUVECs，Co-IP检测VEGF处理HUVECs后磷酸化occludin的泛素化。
5.将野生型和模拟occludin去磷酸化的质粒S490A转染入HUVECs，Co-IP检测VEGF处理HUVECs后野生型occludin与去磷酸化occludin的磷酸化。
6.Western Blotting检测VEGF处理HUVECs后细胞内ERK，PKC，FAK信号通路的变化。
7.用蛋白质合成抑制剂放线菌酮预处理HUVECs后，用VEGF及泛素-蛋白酶体途径抑制剂MG132处理HUVECs，观察HUVECs紧密连接蛋白occludin表达水平的变化。
8.用VEGF以及蛋白酶体途径抑制剂MG132处理HUVECs，观察occludin的泛素化。
研究结果：
1.免疫组化显示，在预转移阶段肺组织中，存在第490位丝氨酸磷酸化的occludin。
2.Western Blotting显示，VEGF处理HUVECs15min能够诱导血管内皮细胞中紧密连接蛋白occludin第490位丝氨酸发生磷酸化。
3.Co-IP实验证实，VEGF诱导occludin发生单泛素化以及多泛素化。
4.分别以模拟occludin磷酸化和去磷酸化的质粒转染HUVECs，发现occludin第490位丝氨酸的磷酸化是VEGF诱导occludin发生泛素化所必须的。
5.VEGF处理HUVEC诱导ERK信号通路的活跃表达。ERK抑制剂可以抑制occludin第490位丝氨酸的磷酸化以及occludin的下调。表明VEGF通过激活ERK信号通路，促进occludin发生磷酸化-泛素化。
6.VEGF通过加速occludin的降解引起occludin的下调。VEGF是通过泛素-蛋白酶体途径诱导的occludin降解。VEGF能够加速occludin的降解。
研究结论：
VEGF诱导occludin发生磷酸化-泛素化，使其经泛素-蛋白酶体途径降解，导致紧密连接蛋白occludin表达下调。
本研究第一部分内容利用4T1乳腺癌肺转移模型验证了原发肿瘤分泌的VEGF导致预转移肺组织血管通透性升高以及紧密连接蛋白occludin下调。第二部分进一步探讨了VEGF引起occludin下调的机制。本研究旨在寻找在预转移小生境中VEGF诱导血管内皮通透性升高的潜在下游分子，从而为预防肺预转移小生境的形成提供治疗策略。
第一部分 原发肿瘤分泌的VEGF通过下调紧密连接蛋白occludin诱导预转移小生境中血管通透性升高
研究目的：
探讨原发肿瘤诱导预转移小生境中血管通透性升高的可能机制。
研究方法：
1.乳腺癌肺转移模型的建立:于6-8周龄的雌性Barb/c小鼠第四对乳腺原位注射4T1乳腺癌细胞，建立乳腺癌肺转移模型。
2.HE染色及肺组织干湿比计算观察预转移阶段原发乳腺癌对肺组织血管通透性的影响。
3.ELISA法检测荷瘤小鼠及4T1乳腺癌细胞培养基上清中细胞因子的表达。
4.血管通透性实验:BALB/c小鼠接种4T1细胞后第14天，尾静脉注射结合罗丹明B异硫氰酸酯的低分子葡聚糖(rhodamine-conjugated dextran，70 kD)，4h后尾静脉注射结合绿色荧光蛋白的凝集素(FITC-lectin)，30 min后进行心脏灌洗。灌洗完毕后解剖小鼠，留取肺组织，将肺组织制成冰冻切片，于显微镜下观察。
5.Western Blotting及免疫荧光观察原发乳腺癌对肺组织中紧密连接蛋白occludin表达的影响。
6.VEGF处理HUVECs，观察VEGF对血管内皮细胞通透性以及内皮细胞中紧密连接蛋白occludin含量的影响。
7.贝伐珠单抗处理HUVECs，观察贝伐珠单抗对VEGF诱导的血管内皮细胞通透性升高以及内皮细胞中紧密连接蛋白occludin下调的影响。
8.贝伐珠单抗处理荷瘤小鼠，观察贝伐珠单抗对原发肿瘤诱导的转移前肺组织血管通透性升高的影响。
9.将occludin过表达质粒转染进HUVECs，观察occludin对血管内皮细胞通透性的调节作用。
研究结果：
1.在预转移阶段，与对照组相比，荷瘤组小鼠肺组织肿胀，肺组织含水量增加。HE染色显示，建立原发乳腺癌模型之后，荷瘤组小鼠肺组织中出现炎症细胞浸润，并且随着肿瘤的生长，炎症反应逐渐加重。
2.动物实验证实，在预转移阶段，荷瘤小鼠肺组织血管通透性升高。
3.ELISA实验显示，在荷瘤小鼠血清及4T1乳腺癌细胞的培养基上清中，VEGF表达显著升高。
4.应用贝伐珠单抗处理小鼠，能够抑制原发肿瘤诱导的肺组织血管通透性升高。
5.Western Blotting及免疫荧光显示，原发乳腺癌能够诱导预转移阶段小鼠肺组织中紧密连接蛋白occludin表达下调。
6.在体外实验中，Western Blotting及免疫荧光显示，VEGF能够诱导血管内皮细胞通透性升高以及HUVECs中紧密连接蛋白occludin表达下调。
7.应用贝伐珠单抗处理HUVECs，能够降低VEGF诱导的血管内皮细胞通透性升高以及occludin表达下调。
8.过表达occludin能够部分阻断VEGF诱导的血管内皮细胞通透性的升高。
研究结论：
1.原发肿瘤分泌的VEGF诱导转移前期肺组织中血管通透性升高。
2.原发肿瘤分泌的VEGF通过诱导occludin表达下调导致血管通透性升高。
第二部分 原发肿瘤分泌的VEGF通过磷酸化-泛素化途径诱导紧密连接蛋白occludin表达下调
研究目的：
探讨VEGF诱导occludin表达下调的可能机制。
研究方法：
1.免疫荧光染色检测预转移阶段对照组和实验组小鼠肺组织中磷酸化occludin的表达。
2.Western Blotting检测VEGF处理HUVECs后紧密连接蛋白occludin第490位丝氨酸的磷酸化。
3.Co-IP检测VEGF处理HUVECs后occludin的泛素化。
4.将模拟occludin磷酸化的质粒S490D转染入HUVECs，Co-IP检测VEGF处理HUVECs后磷酸化occludin的泛素化。
5.将野生型和模拟occludin去磷酸化的质粒S490A转染入HUVECs，Co-IP检测VEGF处理HUVECs后野生型occludin与去磷酸化occludin的磷酸化。
6.Western Blotting检测VEGF处理HUVECs后细胞内ERK，PKC，FAK信号通路的变化。
7.用蛋白质合成抑制剂放线菌酮预处理HUVECs后，用VEGF及泛素-蛋白酶体途径抑制剂MG132处理HUVECs，观察HUVECs紧密连接蛋白occludin表达水平的变化。
8.用VEGF以及蛋白酶体途径抑制剂MG132处理HUVECs，观察occludin的泛素化。
研究结果：
1.免疫组化显示，在预转移阶段肺组织中，存在第490位丝氨酸磷酸化的occludin。
2.Western Blotting显示，VEGF处理HUVECs15min能够诱导血管内皮细胞中紧密连接蛋白occludin第490位丝氨酸发生磷酸化。
3.Co-IP实验证实，VEGF诱导occludin发生单泛素化以及多泛素化。
4.分别以模拟occludin磷酸化和去磷酸化的质粒转染HUVECs，发现occludin第490位丝氨酸的磷酸化是VEGF诱导occludin发生泛素化所必须的。
5.VEGF处理HUVEC诱导ERK信号通路的活跃表达。ERK抑制剂可以抑制occludin第490位丝氨酸的磷酸化以及occludin的下调。表明VEGF通过激活ERK信号通路，促进occludin发生磷酸化-泛素化。
6.VEGF通过加速occludin的降解引起occludin的下调。VEGF是通过泛素-蛋白酶体途径诱导的occludin降解。VEGF能够加速occludin的降解。
研究结论：
VEGF诱导occludin发生磷酸化-泛素化，使其经泛素-蛋白酶体途径降解，导致紧密连接蛋白occludin表达下调。