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Thg11(曾用名ICF45),一个新的细胞周期调控相关蛋白,是本实验室在使用自身免疫病人血清筛选HeLa细胞的cDNA表达文库时发现的一个新的胞质蛋白。通过RACE技术获得其全长cDNA,为1.32kb,编码298Aa,理论上的等电点是8.12。免疫荧光分析表明Thg11间期在胞质中靠近核膜的位置形成1-2个点,并与中心体大小和外观相似。
研究中发现Thg11与中心体经常有共定位的情况,为进一步研究Thg11与中心体的位置关系,本研究中采用TdR双阻断的方法将细胞同步于不同的周期时相,观察不同时相Thg11与中心体的定位关系。发现Thg11在G1期开始、经过S期直至有丝分裂前的G2期时与中心体共定位,在发生有丝分裂之前离开中心体。当细胞完成M期时,Thg11又开始向中心体聚集。表明随着细胞周期的进程Thg11的亚细胞定位呈现出周期性变化的特点。
为进一步研究Thg11在细胞周期调控中的作用,我们利用载体介导的RNA干扰技术特异性地沉默Hela细胞中Thg11的表达,并通过筛选获得稳定干扰的克隆细胞株,进行各项生理生化指标的测定。我们同时利用westernblot及蛋白质组学的方法进一步分析了Thg11在周期调控中可能的相关蛋白。
实验结果表明,Thg11被显著沉默的细胞株各项生理指标发生较为明显的变化。在培养中发现,细胞的贴壁性减弱。细胞增殖受到明显抑制,生长非常缓慢。胞质分裂受阻,细胞周期进程被严重破坏,导致多核细胞的大量产生(占细胞总数的18.2+0.4%)。流式细胞光度术分析结果显示,Thg11被沉默后,细胞周期受到一定程度的影响,RNAi细胞中处于G1期的细胞所占比例下降,处于S期与G2期的细胞比例上升。表明细胞在周期无法通过有丝分裂进行增殖,这与细胞增殖受阻生长缓慢相吻合。
我们利用蛋白质组学的方法鉴定了Thg11被有效沉默的细胞株中的26个差异表达蛋白的ID,其中上调蛋白13个,下调蛋白13个,其中发生上调的蛋白包括ACL6A(Actin-likeprotein6A),SFRS1(Splicingfactor,arginine/serine-rich1),PRDX3(Thioredoxin-dependentperoxidereductase)等;发生下调的蛋白包括TIF1B(Transcriptionintermediaryfactor1-beta),COF1(Cofflin-1)等。
这些结果暗示我们Thg11极有可能是细胞正常生长和增殖的一个必要因子,与细胞周期调控密切相关,同时为深入探讨Thg11在细胞周期中的功能及作用通路提供了有价值的资料。