【摘 要】
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金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）是全球范围内危害人类健康的主要食源性致病菌之一,摄入被其污染的食物会增加相关疾病的发生。由于利用传统抗体的金葡免疫检测方法会受到非特异性作用的影响,所以基于常规抗体的金葡免疫检测策略的发展停滞不前。基于纳米抗体不含有可以与金葡进行非特异性结合的可结晶段的独特性质,因此可以大大提高特异性。本研究旨在制备金葡特异性纳米抗体并
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金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）是全球范围内危害人类健康的主要食源性致病菌之一,摄入被其污染的食物会增加相关疾病的发生。由于利用传统抗体的金葡免疫检测方法会受到非特异性作用的影响,所以基于常规抗体的金葡免疫检测策略的发展停滞不前。基于纳米抗体不含有可以与金葡进行非特异性结合的可结晶段的独特性质,因此可以大大提高特异性。本研究旨在制备金葡特异性纳米抗体并构建免疫检测方法,用于食品基质中金葡的快速检测。本研究基于噬菌体展示技术,制备了针对金黄色葡萄球菌的特异性纳米抗体并建立了双抗夹心ELISA免疫检测方法。首先制备了免疫用灭活菌株,通过甲醛灭活及ELISA实验确定了灭活条件和免疫菌株,小鼠经皮下免疫灭活菌株验证免疫安全性,相同剂量皮下注射免疫羊驼,免疫结束后提取外周血淋巴细胞,基于巢式PCR技术构建了一个库容量为2.52×1011cfu、多样性为7.56×10~7cfu的纳米抗体免疫文库。通过PE-ELISA对特异性识别金黄色葡萄球菌的纳米抗体进行筛选,得到10个特异性纳米抗体,经基因测序、氨基酸序列对比验证所筛选到的纳米抗体属于四个抗体家族,并分别命名为Nb85、Nb119、Nb147和Nb174,纳米抗体的表达基于大肠杆菌表达体系,经镍亲和层析和尺寸排阻层析后制备了纯化的纳米抗体,对纳米抗体的理化性质和生物学活性,包括纯度、热稳定性、特异性以及交叉反应等方面进行评价和表征。本研究为避免在免疫检测方法中使用传统抗体作为信号检测手段,制备了生物素化的纳米抗体,经表达纯化后建立了基于纳米抗体的针对金黄色葡萄球菌的双抗夹心ELISA方法。通过将4种针对金黄色葡萄球菌的特异性纳米抗体两两配对,筛选出Nb147和Bio-Nb147分别作为捕获抗体和检测抗体建立了双抗夹心ELISA检测方法,经优化后捕获抗体Nb147浓度为10μg/m L、检测抗体Bio-Nb147为15μg/m L。构建的双抗夹心ELISA检测方法的最低检测限LOD为1.4×10~5cfu/m L。以脱脂牛奶样品进行加标回收实验,回收率为97%～110%,并可用于牛奶中金黄色葡萄球菌富集8 h后的检测,结果表明该方法在食品安全检测方面具有可行性和适用性。
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