人呼吸道腺病毒通用特异检测试剂的基础研究及应用

• 作 者: 陈晶
• 机 构: 哈尔滨医科大学
• 出 处: 哈尔滨医科大学
• 发表日期: 2007年期
• 关键词: 呼吸道腺病毒 检测试剂 聚合酶链反应 序列测定

目的：腺病毒是人类呼吸道、胃肠道、眼等部位许多疾患的重要病原之一。在儿童急性感染性疾病中，2％～7％是由腺病毒引起的，并可造成一定范围的流行。由于腺病毒型别较多(共51个血清型)，给实验室诊断带来一定困难，目前尚无一种理想的常规实验室诊断方法。本实验旨在建立一种特异性强、灵敏度高、操作简便的呼吸道腺病毒检测方法，为临床呼吸道腺病毒通用特异诊断试剂的研发奠定实验基础。
方法：对GenBank中已收录的10个型别人呼吸道腺病毒核酸全序列进行比对分析，找出高度保守序列，对保守序列进行评价，设计5对腺病毒通用特异引物。在进行上、下游引物组配时，尽量选择引物保守而其间的核酸序列各型别同源性较低的区段，确保PCR产物具有型别特异性。在模板制备上，选择简便、快速的NP-40裂解法。对引物的有效性、特异性及灵敏性进行验证，并应用于临床咽拭子标本检测，阳性标本的PCR产物直接测序鉴定血清型。进而，将阳性标本接种HeLa细胞观察细胞病变，并制作电镜标本观察病毒形态。
结果：所设计的5对引物具有3个特点：①引物位于呼吸道腺病毒的保守区，可检测到所有的呼吸道腺病毒——腺病毒通用引物；②引物序列与其他病毒、细菌及人类基因组等无高度同源性，只能用于检测腺病毒——腺病毒特异引物；③引物扩增产物各腺病毒型别特异，对该PCR产物测序后可确定检测到的腺病毒的型别——腺病毒型特异性引物。5对引物扩增人3型腺病毒DNA均出现阳性目的条带，证明这5对引物均可有效地检测到腺病毒DNA，验证了引物的有效性。用第4对引物进行敏感性检测结果表明，该引物可检测到稀释至10<-5>的病毒样品和模板DNA样品，证明该方法敏感。同时，病毒样品和模板DNA样品的PCR结果平行，验证了NP-40标本裂解法的稳定性。应用该引物从64例临床标本中检测出2例阳性标本，阳性率为3.13％。用阳性标本接种HeLa细胞，光镜下可见细胞变圆、聚集成葡萄串状、脱落等腺病毒所致细胞病变，电镜下可见细胞核内有典型的晶格状排列的腺病毒颗粒。进一步用分离到的腺病毒为模板，用5对引物进行PCR扩增，结果均出现阳性目的条带，对这些PCR产物的测序结果表明，2株病毒均为B组腺病毒。
结论：本实验设计了腺病毒通用的、特异的，同时扩增产物又具有腺病毒型别特异性的引物。用该引物建立的PCR方法检测呼吸道标本中的腺病毒DNA具有灵敏和特异的特点，一次可检测大量标本，适用于临床常规诊断腺病毒感染。同时，对检测到的PCR产物测序，可鉴定出腺病毒的型别，用于腺病毒的型别分析和流行病学调查。此方法具有良好的应用前景，易于推广应用，可创造巨大的社会效益和经济效益。