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RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种真核生物体内的基因调控机制，是在真核生物体内由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导体内基因同源序列降解的现象，这是一种转录后水平的基因沉默(post-transcriptional genesilence，PTGS)，也称RNA沉默(RNA silence)。RNAi的主要过程是dsRNA被核酸酶切割成21～25 nt的干扰性小分子RNA(small interference RNA，siRNA)，siRNA是RNA干扰作用的中间效应分子，可以与蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex，RISC)，识别并靶向切割同源性靶mRNA分子，使mRNA分子降解，基因沉默出现。RNAi具有高度的序列专一性，能使特定基因功能丧失或降低突变，从而确定其功能，因此广泛应用于功能基因组的研究。
旋毛形线虫可感染人及150多种动物，引起的旋毛虫病是一种人兽共患寄生虫病，严重危害人类健康和畜牧业生产。由于旋毛虫病的诊断比较困难，因而对该病的预防尤为重要。目前，由于旋毛虫不能在体外传代培养，难以获得大量全虫抗原，阻碍了其疫苗研制。随着基因重组技术的发展，由基因重组抗原制备的疫苗在其它寄生虫病的免疫预防上取得很大进步。因此，利用基因工程手段研究其功能基因并获取或制备有效的疫苗候选抗原分子一直是人们研究的热点。
本课题组通过分子生物学方法从旋毛虫cDNA表达文库中筛选得到Ts87抗原新基因，并且证实Ts87基因具有良好的免疫保护性。为研究旋毛虫Ts87基因的功能以及RNAi对于Ts87基因的干扰效果，通过体内、体外两种途径抑制目的基因的表达。通过以上两部分实验，观察RNAi对于Ts87基因产生的干扰效果以及对肌幼虫体外存活率、雌虫生殖力的影响，从而对Ts87基因功能进行初步研究。
在体外实验中，根据Ts87基因设计特异性siRNA并采用化学合成法合成，利用脂质体试剂Lipofectamine2000将不同浓度的siRNA与pcDNA3.1-Ts87重组质粒共转染Cos-7细胞。利用实时荧光定量PCR分析Ts87基因及Cos-7细胞管家基因β-actin mRNA的表达，从而计算得出Ts87基因的相对含量。实时荧光定量PCR结果，与阴性对照组相比(即Ts87基因的相对含量为1)，不同浓度的siRNA能引起Ts87基因mRNA表达水平不同程度的降低，均有统计学差异(P<0.01)。其中，50nM siRNA转染Cos-7细胞后，对Ts87基因mRNA表达水平抑制作用较强，在24h、48h和72h Ts87基因mRNA相对含量分别下降到(75.6±3.0)％、(23.4±2.4)％、(26.9±3.4)％。体外实验结果证实了RNAi可作为干扰Ts87基因的有效工具，为实现体内阻抑Ts87基因奠定了基础。在体内实验中，针对Ts87基因序列设计并合成特异性的FAM-siRNA以及dsRNA、siRNA，其中dsRNA采用体外转录方法合成。首先，将带有荧光标记的FAM-siRNA分别通过浸泡、电穿孔两种方式导入肌幼虫体内，检测导入途径的可行性。然后，分别将FAM-siRNA以及dsRNA、siRNA导入肌幼虫体内，利用实时荧光定量PCR分析Ts87基因及旋毛虫管家基因GAPDH的表达，检测dsRNA浓度变化对于Ts87基因干扰效果的影响、三个双链RNA干扰效率的不同以及RNAi基因抑制作用的持久性。此外，测定RNA干扰作用下的肌幼虫存活率以及雌虫生殖力的变化。结果显示：
第一，FAM-siRNA通过浸泡及电穿孔之后的肌幼虫体内有荧光信号出现，同时虫体内Ts87基因mRNA相对含量明显下降(P<0.01)，因此证实浸泡及电穿孔两种导入途径的可行性。
第二，将不同浓度的dsRNA导入肌幼虫体内，利用实时荧光定量PCR分析Ts87基因mRNA相对含量发现，当dsRNA的浓度为100、10、1ug/mL，时，肌幼虫体内的Ts87基因表达水平在处理后均产生了明显的统计学差异(P<0.01)；而当dsRNA的浓度为0.1ug/mL时，无统计学差异。这就表明RNAi基因阻抑效应与dsRNA的浓度有关。
第三，比较dsRNA、siRNA、FAM-siRNA对于Ts87基因的阻抑作用，三者均能够降低Ts87基因mRNA的表达水平(P<0.01)，但程度不同，其中dsRNA作用相对较强。
第四，通过浸泡途径将dsRNA导入肌幼虫体内，发现至处理后的第15天仍能引起Ts87基因表达水平的降低(P<0.01)。第五，dsRNA、siRNA、FAM-siRNA能够在一定程度上降低肌幼虫体外存活率，但对于雌虫生殖力无显著影响。推测Ts87基因对于肌幼虫的生长发育可能有一定的作用。根据本实验的结果，研究证实RNAi是干扰Ts87基因的有效工具，为旋毛虫的基因功能研究创建了新的技术平台，同时为加快旋毛虫基因功能的分析以及基因工程疫苗的研制奠定了基础。