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心肌细胞膜上存在着两种不同电流特性的钙通道:L 型钙通道和T 型钙通道。与 T 型钙通道相比,L 型钙通道具有大电导、高电压激活、长时间开放、能和多种拮抗剂作用的特点。就功能而言,L 型钙通道电流(Ica-L)不仅参与心肌动作电位平台期的形成和维持,而且在心肌兴奋-收缩耦联中起着极为重要的作用。L 型Ca2+通道是异源多聚蛋白质复合体,至少由四个亚单位组成,包括α1、β、α2/δ,α1 亚单位是通道的主要功能单位。目前已知,在哺乳类组织,编码 L 型Ca2+通道α1 亚单位的基因有四种,根据其来源分别称作α1S、α1C、α1D和α1F;对应于基因名法,分别是 Cav1.1、Cav1.2、Cav1.3和Cav1.4。最初人们认为心脏中的 L 型钙通道仅包括α1C(Cav1.2),但后来发现α1D(Cav1.3)在心脏中也有表达,并且优势表达于窦房结、房室结和心房,加之发现它在比较低的膜电位(-60~50mv)激活而且α1D基因敲除小鼠表现出窦性心动过缓和房室传导阻滞,所有这些都表明α1D在维持正常的心脏节律中发挥着至关重要的作用。
本实验室前期以 Cav1.3 钙离子通道α1D 亚单位位于胞内的C 末端为诱饵,用酵母双杂交方法从人心脏 cDNA 文库中筛选出了一种新型相互作用蛋白Snapin。Snapin 是一种广谱表达的蛋白,有研究表明其在 SNAREs所介导的膜融合过程中起辅助作用。
本论文首先利用外源性过表达Cav1.3 钙离子通道与 Snapin 蛋白的HEK293 细胞及内源性表达二者的心房肌组织作为研究对象,通过免疫细胞化学及免疫共沉淀技术证明 Cav1.3 钙离子通道与Snapin 蛋白在哺乳系统中存在相互作用;在此基础上进一步利用外源性过表达 Cav1.3 钙离子通道与Snapin 蛋白的 HEK293 细胞作为研究对象,通过膜片钳技术进一步分析了 Snapin 蛋白对 Cav1.3 钙离子通道的调节作用。结果如下:
1. Cav1.3 钙离子通道与 Snapin 蛋白在细胞膜上共定位利用外源性过表达 Cav1.3 钙离子通道与 Snapin 蛋白的 HEK293 细胞及分离的小鼠心房肌细胞为研究对象进行免疫荧光实验,结果表明 Cav1.3 钙离子通道与 Snapin 蛋白在细胞膜上有共定位现象。2. Cav1.3 钙离子通道与 Snapin 蛋白存在相互作用利用过表达 Cav1.3 钙离子通道与 Snapin 蛋白的 HEK293 细胞及内源性表达二者的小鼠心房组织为研究对象提取蛋白进行免疫共沉淀实验,结果表明Cav1.3 钙离子通道与 Snapin 蛋白存在相互作用。
3. Snapin 蛋白对 Cav1.3 钙离子通道电生理特性的影响在证实 Cav1.3 钙离子通道与 Snapin 蛋白存在相互作用的基础上,我们进一步利用外源性过表达二者的 HEK293 细胞作为研究对象,通过全细胞膜片钳技术来分析Snapin 蛋白对 Cav1.3 钙离子通道电生理特性的影响。结果表明Snapin 蛋白显著减小了 Cav1.3 钙离子通道的电流(Ica-L)密度,加速了Cav1.3钙离子通道的稳态激活过程并延迟了Cav1.3 钙离子通道的失活后再恢复过程。
综上所述,Snapin 蛋白与 Cav1.3 钙离子通道在哺乳系统中可发生相互作用,并影响了 Cav1.3 钙通道的电生理特性:电流密度降低、稳态激活过程加速、失活后再恢复过程延迟。说明 Snapin 蛋白可通过调节Cav1.3 钙离子通道来参与调节细胞膜的兴奋性。