小鼠输卵管上皮细胞共培养对早期胚胎体外发育的影响

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目的:本试验的主要目的是研究输卵管上皮细胞(OECs)共培养对小鼠早期胚胎发育和质量的影响,同时研究胚胎对共培养的OECs的作用以及氧化应激对OECs共培养体系的影响。  方法:应用差速贴壁法纯化OECs系,纯化的OECs用于对合子进行共培养至囊胚期,统计胚胎的发育率和阻滞率,应用DCHFDA染色测定胚胎中的H2O2含量,用MTT法测定上皮细胞活力,利用RT-PCR法检测CAT和GPX基因的转录量,用外源性的H2O2作为氧化应激作用于OECs和胚胎,应用Hochest33342和PI染色检测细胞凋亡状况。  结果:1.从第三代开始形成明显的呈铺路石样的集落,并且其它细胞也被纯化掉,纯化后的OECs用于共培养;  2. OECs共培养能够显著提高2-细胞早期、4-细胞期胚胎发育率(P<0.05),囊胚率也有所提高(P>0.05);  3.小鼠阻滞胚胎的碎片中有H2O2蓄积,通常其荧光强度要高于正常胚胎;  4.OECs共培养能够降低Ⅰ和Ⅱ型阻滞胚胎的比例(P>0.05),提高Ⅲ型阻滞胚胎的比例(P<0.05),因而OECs共培养能够改变阻滞胚胎的分布和降低其损伤程度;  5.体外胚胎中的H2O2含量显著地高于体内胚胎(P<0.05),OECs共培养能够降低MZT时期的H2O2,OECs共培养能够显著降低2-细胞早期胚胎内部的H2O2含量(P<0.05);  6.胚胎对共培养的OECs有一定的作用,当共培养的胚胎发育到2-细胞早期(36 ph hCG)时共培养细胞活力上升(P>0.05);  7.胚胎能够影响共培养的OECs抗氧化能力,当胚胎发育到2-细胞早期时,OECs抗氧化基因CAT及GPX转录量增加(P>0.05);  8.胚胎自身有抵抗ROS的能力,用0.12 ppM的H2O2处理小鼠合子30 min能够诱发体外发育阻滞,把该处理作为氧化应激的条件;  9.氧化应激能够导致OECs的促进发育能力降低,OECs用H2O2处理后不能显著地提高H2O2处理胚胎的2-细胞早期和4-细胞期发育率;  10.OECs对ROS很敏感,当共培养的细胞发育到36和60 h phCG时,H2O2处理的OECs活力低于对照组,当该OECs再被用于共培养时,其活力将会继续降低(P﹤0.05);  11.Hochest33342和 PI染色可知,氧化应激能够诱导OECs和胚胎的凋亡,甚至死亡,因而此时的OECs不能提高合子的发育。  结论:1. OECs共培养能够促进小鼠胚胎的发育,提高胚胎质量,降低MZT时期的细胞内H2O2含量,降低阻滞胚胎的损伤程度;  2. OECs共培养通过细胞-细胞间的相互而影响OECs的活力和抗氧化能力;  3.氧化应激能够诱导OECs和胚胎的凋亡,甚至死亡,因而此时的OECs不能有效地发挥作用。
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