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目的：
将大脑皮质星形胶质细胞通过不同损伤模型活化为不同类型的反应性星形胶质细胞，探讨知母皂苷元（sarsasapogenin，SAR）介导SHH（sonichedgehog，SHH）信号通路作用于不同类型的反应性星形胶质细胞（reactiveastrocytes，RAS）获得神经干细胞潜能的影响，为临床上神经内外科治疗中枢神经系统疾病过程中将SAR作为辅助治疗手段提供一定的理论依据。
方法：
1提取新生SD大鼠大脑皮质原代星形胶质细胞：从新生1～3dSD大鼠大脑皮质中提取星形胶质细胞，置于37℃、5%CO2细胞孵箱中培养纯化，通过免疫荧光染色检测星形胶质细胞纯度，用于制备RAS。
2划痕试验制备划痕组RAS：划痕损伤后，冲洗细胞碎片和杂质，更换培养基继续培养。
3制备炎症组RAS：在正常星形胶质细胞中添加白细胞介素1α（interleukin1alpha，IL-1α）、肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactorα，TNFα）、补体C1q三种细胞因子诱导成为炎症型RAS。
4两组不同损伤类型RAS的比较：利用通过实时荧光定量PCR（realtime-PCR，qRT-PCR），检测两组RAS中基因的差异，确定不同损伤方法所诱导的RAS类型不同。
5巢蛋白（Nestin）及SHH表达量：试验细胞分为三组：对照组（普通星形胶质细胞）、划痕组和炎症组。炎症组培养至干预后24h、划痕组培养至第7天使用免疫荧光染色检测三组细胞的Nestin和SHH蛋白表达量。利用蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测划痕组和炎症组细胞中SHH表达量。
6SAR对SHH信号通路的影响：试验细胞分为五组：对照组（普通星形胶质细胞）、划痕组、炎症组、划痕+SAR组、炎症+SAR组，通过qRT-PCR，观察各组细胞中SHH信号通路相关基因Smo、Gli1、Ptch1的表达趋势。
7诱导RAS转分化：各组细胞行SHH信号通路激动剂（smoothenedagonist，SAG）、SHH信号通路抑制剂（cyclopamine，CYC）处理，后将培养基更换为神经干细胞条件培养基继续培养。
8SAR介导SHH信号通路对不同细胞模型RAS的神经干细胞相关基因表达量：实验分为SAG组和CYC组，其中SAG组包括对照+SAG组、划痕+SAG组、炎症+SAG组，CYC组包括对照+CYC组、炎症+CYC组、划痕+CYC组、炎症+CYC+SAR组、划痕+CYC+SAR组，通过qRT-PCR观察各组神经干细胞相关基因Nestin、Pax6、Sox2、Oct4和Map2的表达水平。
9建立动物实验模型：实验模型共分为颅脑创伤（traumaticbraininjury，TBI）组和神经炎症组（LPS组）。TBI组使用电子控制性脑皮质撞击仪（eCCI）制造模型（仅损伤至大脑皮质区）。LPS组为大鼠腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）。
10动物模型Nestin及SHH蛋白表达量：试验组分为sham组、TBI组和LPS组。使用免疫荧光染色和Westernblot检测三组模型中的Nestin及SHH蛋白表达量。
11药物给予：使用大鼠大脑立体定位仪和微量进样针对两组动物模型进行大脑皮层定位注射SAG和cyclopamine。采取灌胃方式对大鼠进行SAR给药。
12SAR对SHH信号通路的影响：试验分为sham组、LPS组、TBI组、LPS+SAR组和TBI+SAR组，通过qRT-PCR实验，观察SHH信号通路相关基因表达水平。
13SAR介导SHH信号通路对不同动物模型RAS的神经干细胞相关基因表达量：实验分为SAG组和CYC组，SAG组中包括假手术组+SAG（sham+SAG组）、LPS+SAG组、TBI+SAG组，CYC组分为假手术组+CYC（sham+CYC组）、LPS+CYC组、TBI+CYC组、LPS+CYC+SAR组和TBI+CYC+SAR组，通过qRT-PCR观察各组神经干细胞相关基因Nestin、Pax6、Sox2、Oct4和Map2的表达趋势。
14Morris水迷宫检测SAR介导SHH信号通路对损伤大鼠的空间探索能力和记忆能力的影响：大鼠分为LPS组和TBI组。LPS组包括sham组、LPS组、LPS+CYC组、LPS+CYC+SAR组，TBI组包括sham组、TBI组、TBI+CYC组、TBI+CYC+SAR组，对各组大鼠的学习和记忆能力进行测试。
结果：
1星形胶质细胞的纯度检测：原代大脑皮质星形胶质细胞培养至第3次传代后，利用胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）免疫荧光染色，检测星形胶质细胞的GFAP阳性细胞率达到94%以上。
2划痕试验和炎症因子诱导后RAS的比较：两组RAS的细胞形态均发生改变，胞体均增肥增大，突起增多，胞浆丰富。qRT-PCR结果发现，炎症组RAS中A1型反应性星形胶质细胞（A1reactiveastrocytes，A1s）的特异性基因表达水平明显升高（P＜0.01），而划痕组RAS中A1s相关基因表达水平较对照组无明显改变（P＞0.05）。
3免疫荧光染色检测各组中Nestin和SHH阳性细胞率：两损伤组中的Nestin阳性细胞率均升高（P＜0.01），与炎症组相比，划痕组中Nestin和SHH阳性细胞率升高显著（P＜0.01）。
4Westernblot检测两损伤组细胞中SHH的表达量：与炎症组相比，划痕组中的SHH蛋白表达量更多（P＜0.05），所得结论与免疫荧光染色相同。
5qRT-PCR观察SAR对各组细胞中SHH信号通路的影响：添加SAR前各损伤组较对照组Smo、Gli1和Ptch1基因表达水平均有不同程度升高（P＜0.05），其中划痕组改变较炎症组显著，添加SAR后，损伤组中Smo和Ptch1基因表达水平均再次提高（P＜0.01），Gli1则无明显改变，无统计学意义（P＞0.05）。
6qRT-PCR检测SHH信号通路介导不同RAS神经干细胞相关基因表达水平：添加SAG后，各组细胞的神经干细胞相关基因Nestin、Pax6、Sox2、Oct4和Map2表达水平均升高，其中划痕组较炎症组增高明显（P＜0.05）。添加cyclopamine后，各组细胞中各基因表达水平显著降低（P＜0.01），且三组间无明显差异（P＞0.05），再添加SAR后，损伤组中的神经干细胞基因表达水平又出现明显升高（P＜0.01），且表达水平升高趋势与仅添加SAG的趋势相似。
7各组脑组织中Nestin及SHH表达量：与sham组相比，TBI组和LPS组中的Nestin和SHH阳性细胞率均增多，其中TBI组增多较显著（P＜0.01）。Westernblot显示：与sham组相比，两损伤组中SHH蛋白表达量均明显增多（P＜0.01），其中TBI组较LPS组增多明显（P＜0.01）。
8qRT-PCR观察各组脑组织中SAR对SHH信号通路的影响：与sham组相比，各损伤组中各基因表达水平均有不同程度升高（P＜0.01），其中TBI组较LPS组升高显著，给予SAR后，损伤组中Smo和Ptch1表达水平均再次出现升高趋势（P＜0.01），Gli1在给药前后无明显改变（P＞0.05）。
9qRT-PCR检测各组脑组织中SHH信号通路介导不同RAS神经干细胞相关基因表达水平：添加SAG后，各组脑组织的神经干细胞相关基因表达水平均有升高（P＜0.05），其中TBI组较LPS组增高明显（P＜0.05）。添加cyclopamine后，各损伤组中基因表达水平显著降低（P＜0.01），且三组间无明显差异（P＞0.05），SAR给药后，TBI+CYC+SAR组、LPS+CYC+SAR组中基因表达水平再次出现升高（P＜0.01），且表达水平升高趋势与仅添加SAG的作用相似。
10SAR介导SHH信号通路对损伤大鼠的空间探索能力和记忆能力的影响：与健康大鼠对比，各损伤组大鼠的潜伏期延长（P＜0.01），平台穿越次数及目的象限停留时间减少（P＜0.01），而SAR给药后，各组大鼠的潜伏期缩短，平台穿越次数及目标象限停留时间均增加（P＜0.01）。
结论：
1在细胞实验和动物实验中，创伤诱导的RAS与炎症诱导RAS都具有差异，且不同分型的RAS所表达的Nestin和SHH蛋白不同，提示被诱导为RAS源性神经干细胞的转归具有差异。
2SAR能够通过上调SHH信号通路的Smo和Ptch1基因，一定程度阻断SHH信号通路抑制剂的作用，恢复部分该信号通路的表达和传导。
3在细胞实验和动物实验中，SAR均能基于SHH信号通路诱导不同损伤类型RAS中神经干细胞相关基因表达水平提高，而经过创伤诱导的RAS对神经干细胞相关基因表达水平升高趋势较炎症诱导的RAS较显著，因此可能更易获得神经干细胞的潜能。动物实验中，SAR能够促进中枢神经系统受损后大鼠的学习和记忆能力恢复。
4本研究为临床上神经内外科治疗中枢神经系统疾病过程中将SAR作为辅助治疗手段提供一定的理论依据。
将大脑皮质星形胶质细胞通过不同损伤模型活化为不同类型的反应性星形胶质细胞，探讨知母皂苷元（sarsasapogenin，SAR）介导SHH（sonichedgehog，SHH）信号通路作用于不同类型的反应性星形胶质细胞（reactiveastrocytes，RAS）获得神经干细胞潜能的影响，为临床上神经内外科治疗中枢神经系统疾病过程中将SAR作为辅助治疗手段提供一定的理论依据。
方法：
1提取新生SD大鼠大脑皮质原代星形胶质细胞：从新生1～3dSD大鼠大脑皮质中提取星形胶质细胞，置于37℃、5%CO2细胞孵箱中培养纯化，通过免疫荧光染色检测星形胶质细胞纯度，用于制备RAS。
2划痕试验制备划痕组RAS：划痕损伤后，冲洗细胞碎片和杂质，更换培养基继续培养。
3制备炎症组RAS：在正常星形胶质细胞中添加白细胞介素1α（interleukin1alpha，IL-1α）、肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactorα，TNFα）、补体C1q三种细胞因子诱导成为炎症型RAS。
4两组不同损伤类型RAS的比较：利用通过实时荧光定量PCR（realtime-PCR，qRT-PCR），检测两组RAS中基因的差异，确定不同损伤方法所诱导的RAS类型不同。
5巢蛋白（Nestin）及SHH表达量：试验细胞分为三组：对照组（普通星形胶质细胞）、划痕组和炎症组。炎症组培养至干预后24h、划痕组培养至第7天使用免疫荧光染色检测三组细胞的Nestin和SHH蛋白表达量。利用蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测划痕组和炎症组细胞中SHH表达量。
6SAR对SHH信号通路的影响：试验细胞分为五组：对照组（普通星形胶质细胞）、划痕组、炎症组、划痕+SAR组、炎症+SAR组，通过qRT-PCR，观察各组细胞中SHH信号通路相关基因Smo、Gli1、Ptch1的表达趋势。
7诱导RAS转分化：各组细胞行SHH信号通路激动剂（smoothenedagonist，SAG）、SHH信号通路抑制剂（cyclopamine，CYC）处理，后将培养基更换为神经干细胞条件培养基继续培养。
8SAR介导SHH信号通路对不同细胞模型RAS的神经干细胞相关基因表达量：实验分为SAG组和CYC组，其中SAG组包括对照+SAG组、划痕+SAG组、炎症+SAG组，CYC组包括对照+CYC组、炎症+CYC组、划痕+CYC组、炎症+CYC+SAR组、划痕+CYC+SAR组，通过qRT-PCR观察各组神经干细胞相关基因Nestin、Pax6、Sox2、Oct4和Map2的表达水平。
9建立动物实验模型：实验模型共分为颅脑创伤（traumaticbraininjury，TBI）组和神经炎症组（LPS组）。TBI组使用电子控制性脑皮质撞击仪（eCCI）制造模型（仅损伤至大脑皮质区）。LPS组为大鼠腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）。
10动物模型Nestin及SHH蛋白表达量：试验组分为sham组、TBI组和LPS组。使用免疫荧光染色和Westernblot检测三组模型中的Nestin及SHH蛋白表达量。
11药物给予：使用大鼠大脑立体定位仪和微量进样针对两组动物模型进行大脑皮层定位注射SAG和cyclopamine。采取灌胃方式对大鼠进行SAR给药。
12SAR对SHH信号通路的影响：试验分为sham组、LPS组、TBI组、LPS+SAR组和TBI+SAR组，通过qRT-PCR实验，观察SHH信号通路相关基因表达水平。
13SAR介导SHH信号通路对不同动物模型RAS的神经干细胞相关基因表达量：实验分为SAG组和CYC组，SAG组中包括假手术组+SAG（sham+SAG组）、LPS+SAG组、TBI+SAG组，CYC组分为假手术组+CYC（sham+CYC组）、LPS+CYC组、TBI+CYC组、LPS+CYC+SAR组和TBI+CYC+SAR组，通过qRT-PCR观察各组神经干细胞相关基因Nestin、Pax6、Sox2、Oct4和Map2的表达趋势。
14Morris水迷宫检测SAR介导SHH信号通路对损伤大鼠的空间探索能力和记忆能力的影响：大鼠分为LPS组和TBI组。LPS组包括sham组、LPS组、LPS+CYC组、LPS+CYC+SAR组，TBI组包括sham组、TBI组、TBI+CYC组、TBI+CYC+SAR组，对各组大鼠的学习和记忆能力进行测试。
结果：
1星形胶质细胞的纯度检测：原代大脑皮质星形胶质细胞培养至第3次传代后，利用胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）免疫荧光染色，检测星形胶质细胞的GFAP阳性细胞率达到94%以上。
2划痕试验和炎症因子诱导后RAS的比较：两组RAS的细胞形态均发生改变，胞体均增肥增大，突起增多，胞浆丰富。qRT-PCR结果发现，炎症组RAS中A1型反应性星形胶质细胞（A1reactiveastrocytes，A1s）的特异性基因表达水平明显升高（P＜0.01），而划痕组RAS中A1s相关基因表达水平较对照组无明显改变（P＞0.05）。
3免疫荧光染色检测各组中Nestin和SHH阳性细胞率：两损伤组中的Nestin阳性细胞率均升高（P＜0.01），与炎症组相比，划痕组中Nestin和SHH阳性细胞率升高显著（P＜0.01）。
4Westernblot检测两损伤组细胞中SHH的表达量：与炎症组相比，划痕组中的SHH蛋白表达量更多（P＜0.05），所得结论与免疫荧光染色相同。
5qRT-PCR观察SAR对各组细胞中SHH信号通路的影响：添加SAR前各损伤组较对照组Smo、Gli1和Ptch1基因表达水平均有不同程度升高（P＜0.05），其中划痕组改变较炎症组显著，添加SAR后，损伤组中Smo和Ptch1基因表达水平均再次提高（P＜0.01），Gli1则无明显改变，无统计学意义（P＞0.05）。
6qRT-PCR检测SHH信号通路介导不同RAS神经干细胞相关基因表达水平：添加SAG后，各组细胞的神经干细胞相关基因Nestin、Pax6、Sox2、Oct4和Map2表达水平均升高，其中划痕组较炎症组增高明显（P＜0.05）。添加cyclopamine后，各组细胞中各基因表达水平显著降低（P＜0.01），且三组间无明显差异（P＞0.05），再添加SAR后，损伤组中的神经干细胞基因表达水平又出现明显升高（P＜0.01），且表达水平升高趋势与仅添加SAG的趋势相似。
7各组脑组织中Nestin及SHH表达量：与sham组相比，TBI组和LPS组中的Nestin和SHH阳性细胞率均增多，其中TBI组增多较显著（P＜0.01）。Westernblot显示：与sham组相比，两损伤组中SHH蛋白表达量均明显增多（P＜0.01），其中TBI组较LPS组增多明显（P＜0.01）。
8qRT-PCR观察各组脑组织中SAR对SHH信号通路的影响：与sham组相比，各损伤组中各基因表达水平均有不同程度升高（P＜0.01），其中TBI组较LPS组升高显著，给予SAR后，损伤组中Smo和Ptch1表达水平均再次出现升高趋势（P＜0.01），Gli1在给药前后无明显改变（P＞0.05）。
9qRT-PCR检测各组脑组织中SHH信号通路介导不同RAS神经干细胞相关基因表达水平：添加SAG后，各组脑组织的神经干细胞相关基因表达水平均有升高（P＜0.05），其中TBI组较LPS组增高明显（P＜0.05）。添加cyclopamine后，各损伤组中基因表达水平显著降低（P＜0.01），且三组间无明显差异（P＞0.05），SAR给药后，TBI+CYC+SAR组、LPS+CYC+SAR组中基因表达水平再次出现升高（P＜0.01），且表达水平升高趋势与仅添加SAG的作用相似。
10SAR介导SHH信号通路对损伤大鼠的空间探索能力和记忆能力的影响：与健康大鼠对比，各损伤组大鼠的潜伏期延长（P＜0.01），平台穿越次数及目的象限停留时间减少（P＜0.01），而SAR给药后，各组大鼠的潜伏期缩短，平台穿越次数及目标象限停留时间均增加（P＜0.01）。
结论：
1在细胞实验和动物实验中，创伤诱导的RAS与炎症诱导RAS都具有差异，且不同分型的RAS所表达的Nestin和SHH蛋白不同，提示被诱导为RAS源性神经干细胞的转归具有差异。
2SAR能够通过上调SHH信号通路的Smo和Ptch1基因，一定程度阻断SHH信号通路抑制剂的作用，恢复部分该信号通路的表达和传导。
3在细胞实验和动物实验中，SAR均能基于SHH信号通路诱导不同损伤类型RAS中神经干细胞相关基因表达水平提高，而经过创伤诱导的RAS对神经干细胞相关基因表达水平升高趋势较炎症诱导的RAS较显著，因此可能更易获得神经干细胞的潜能。动物实验中，SAR能够促进中枢神经系统受损后大鼠的学习和记忆能力恢复。
4本研究为临床上神经内外科治疗中枢神经系统疾病过程中将SAR作为辅助治疗手段提供一定的理论依据。