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我国农产品及食品中有机磷农药多残留现象严重，加强对其监测十分必要。实践证明：以快速检测方法对大量样品进行初筛，仪器方法对阳性样品进行确证，可以大大提高检测效率、降低成本，符合我国国情。目前我国应用的检测农产品中有机磷农药残留的酶抑制法虽然简便、快速，但存在灵敏度低、准确率差等不足。基于抗原-抗体反应的免疫分析法具有灵敏、简便、快速、成本低廉、适合现场筛查等优点，被认为是21世纪最具竞争性和挑战性的快速检测技术。基于此，本论文以危害性较大的二乙氧基有机磷农药类为对象，进行了其半抗原/抗原设计合成、单克隆抗体制备、高效标记物合成、异源包被检测模式研究及多种新型免疫检测方法研究，并重点研究了其抗体的识别机制及免疫检测方法及产品开发应用，取得了重要的创新结果。
(1)二乙氧基有机磷农药类半抗原/抗原结构对抗体性能的影响基于有机磷农药的结构特点，在半抗原设计中首次引入了含单羧酸、不饱和双键和含酰胺键的3种特殊手臂，并借助量化计算与分子模拟手段建立了半抗原与载体蛋白偶联的构象变化模型，阐述了半抗原/抗原结构对抗体性能的影响。结果表明：①单羧酸手臂与载体蛋白偶联后形成的酰胺键易于与半抗原的苯环形成共面结构，所制备的抗体对具有单芳香环或多芳香环的有机磷农药具有良好的识别能力；②含不饱和双键手臂具有良好的刚性支撑作用，可以使抗原决定簇完全暴露在载体蛋白表面；③含酰胺键的手臂呈明显电负性，易于引起动物免疫应答反应，使得所制备的抗体对手臂有将强识别。基于上述发现，探讨了三种特殊手臂的适用范围，丰富了现有关于小分子药物半抗原设计的理论。
(2)二乙氧基有机磷农药类抗体与其农药识别机制研究这是本论文的重点。通过杂交瘤技术制备了抗有机磷农药的广谱特异性单克隆抗体，首次从构效关系、弱相互作用及空间识别3个层面系统深入研究了抗体与有机磷农药的识别机制，取得重要结果：①在构效关系方面，基于量化计算获得有机磷农药及半抗原的最低能量构象及量化参数，分子模拟建立抗体活性数据(IC50)与农药的二维定量构效关系模型(2D-QSAR)和三维定量构效关系模型(3D-QSAR)，首次提出抗体与小分子药物识别的前线轨道理论基础：抗体对小分子农药的识别与药物的最低空轨道能量(ELUMO)和油水分配系数(LogP)有关。②在弱相互作用方面，率先采用荧光光谱、紫外光谱和圆二色谱研究了抗体与有机磷农药反应的热力学参数(熵变、焓变、吉布斯自由能变等)及构象变化，结果表明抗体与有机磷农药的反应属于自发放热反应，疏水作用和静电引力起主导作用，印证了前述的前线轨道理论基础。③在空间识别模型方面，基于分泌单克隆的细胞株采用基因工程技术手段制备了重组单链抗体(scFv)，同源模建及分子对接技术建立了抗体与有机磷农药的空间识别模型，明确了抗体CDR-L3的Thr93、Thr94，CDR-H2的Arg161、Gln170和CDR-H3的Tyr217等氨基酸残基对有机磷农药的识别起着关键作用。上述从3个层面研究抗二乙氧基有机磷农药类抗体与其农药识别的结果，不仅在认识其抗体与农药小分子间识别机制的取得了重要理论进展，而且为建立其他小分子有害物的免疫分析方法提供了思路和手段参考。
(3)建立高灵敏度的异源包被免疫检测模式基于抗体识别的前线轨道理论基础，定向设计了两个异源包被半抗原，建立了有机磷农药的异源包被免疫检测模式，使其对大多数有机磷农药的检测灵敏度比同源包被模式提高了3-5倍。基于该研究结果，提出了以目标待测物或免疫半抗原的部分特征结构作为异源包被半抗原是一种提高免疫分析灵敏度可行的策略，为高效半抗原的定向设计提供了依据。
(4)新型免疫检测方法的建立与应用这也是本论文的重点研究内容之一。基于前述的单克隆抗体及异源包被免疫检测模式，建立了直接竞争酶联免疫分析(dcELISA)、化学发光酶联免疫分析(dcCLEIA)、时间分辨荧光免疫分析(dcTRFIA)及荧光偏振免疫分析(FPIA)4种新型的高通量、多残留免疫检测方法。①与传统的间接竞争模式相比，直接竞争模式的检测方法具有步骤少、操作方便等特点，检测时间可缩短一半，成本更低，适用于大量样品的高通量筛查。②dcELISA方法操作简便，实用性强，结合固相萃取(SPE)前处理技术可同时检测蔬菜样品中对硫磷等13种有机磷农药，定量下限＜100ng/g: dcCLEIA和dcTRFIA具有超高灵敏度的特点，结合SPE及免疫亲和柱(IAC)前处理技术，分别可以检测环境水样品中7个有机磷农药和9个有机磷农药，定量下限分别低于0.1ng/mL和0.5ng/mL；FPIA具有超快速、超简便等特点，检测时间仅需10min，可同时检测蔬菜样品中对硫磷等10种有机磷农药，定量下限低于100 ng/g。③上述4种检测方法的平均样品添加回收率在80％-120%之间，变异系数低于20%，与国家标准方法(HPLC-MS/MS)比对相关系数高于0.92，说明具有准确率、可靠性高等特点。目前，基于上述研究开发的有机磷农药多残留ELISA检测试剂盒和胶体金快速检测试纸条等产品已经进入中试及产业化应用阶段(尚未有同类产品问世)，有望在防止或减少有机磷农药残留超标的农产品上市及保障人们身体健康等方面发挥重要作用。