拟南芥蓝光敏感突变体中SUB2的基因克隆及COP1与EIN3蛋白相互作用的初步研究

• 作 者: 韩婧
• 机 构: 北京师范大学
• 出 处: 北京师范大学
• 发表日期: 2007年期
• 关键词: 基因克隆 信号转导机制 蓝光信号 三联子密码

为了研究蓝光信号转导机制，我们从拟南芥T-DNA 插入突变体库中筛选到一个蓝光敏感突变体 sub2，其突变背景为Wassilewskija(Ws)，突变表型是在弱蓝光(<2.0μmol/m<2>s)下下胚轴较野生型矮。sub2在低强度的红光和远红光下能够正常生长，其下胚轴长度与野生型没有区别。Inverse PCR 找到了一个T-DNA 插入位点，测序结果表明，T-DNA插入位于第四号染色体At4g08810基因的3’非编码区。At4g08810基因编码sUB1蛋白，SUB1是含有552个氨基酸残基的多肽，在C端有EF手形Ca<2+>结合基序。反转录PCR结果显示突变体中SUB1表达比野生型显著下调。SUB1是蓝光信号通路的一个组分，同时调节光敏色素介导的红光信号通路。序列比对结果显示sub2在At4g08810基因中有两个点突变，其中第734个碱基由G变为A，三联子密码由CCG变为CCA，编码的氨基酸没有变化，仍为脯氨酸 (Pro)。第1306个碱基由C变为T，三联子密码由TCT变为TTT，由编码丝氨酸(Ser)变为编码苯丙氨酸(Phe)。第1306个碱基突变导致At4g08810基因编码的第410个氨基酸发生了改变，此处位于SUB1的其中一个EF手形基序内部，可能影响SUB1的功能。sub2与野生型杂交F1代自交获得F2代，F2代有表型植株中部分检测不到T-DNA的存在，暗示sub2的表型与T-DNA插入不连锁。图位克隆将sub2初步定位于第四号染色体上的SSLP分子标记CIW5与NGA8之间。
用蓝光梯度处理黄化苗后，RT-PCR检测到蓝光诱导HY5基因和CHS基因的表达。突变体sub2中HY5基因表达的上调比野生型显著；而野生型中CHS基因表达的上调比sub2显著。说明SUB2的突变影响蓝光信号的传导。
为了研究COP1蛋白是否影响EIN3蛋白的积累，我们用免疫印记检测红光或蓝光梯度处理的拟南芥野生型和cop1-4中EIN3的积累量。实验表明，cop1-4中单色光诱导EIN3的积累量比野生型明显增多。另外，暗处理的cop1-4幼苗中EIN3的积累水平相对较低，这可以解释与暗处理幼苗相比，cop1-4在连续红光或蓝光照射的条件下下胚轴伸长受抑制，下胚轴更短这一表型。