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生物光子学是一门新兴交叉学科。生物光子学技术在可视化研究和实时追踪生命活动过程时具有传统技术手段所不可比拟的优势,它已经渗透到生命科学的诸多领域并产生了深远影响。
植物细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)的分子调控机制研究,有助于全面认识植物抗逆性形成的分子基础。类似于动物细胞凋亡,植物PCD也是由内在遗传程序决定的细胞主动性死亡过程。同时,植物PCD也有自己独特的分子特征和专一性的信号调控网络。研究表明,热激蛋白(Heat shockproteins,HSPs)和热激转录因子(Heat shock transcription factors,HSFs)重要参与到动物细胞凋亡过程中,但它们在植物PCD中的作用仍不清楚;尤其是HSFs,迄今为止,尚未有与植物PCD关系的研究报道。
本论文主要内容是,借助生物光子学技术,活细胞水平上研究了热激诱导植物PCD的分子调控机制。主要结论是,拟南芥HsfA2通过调节胞内氧化还原平衡来调节热激诱导的线粒体途径依赖的植物PCD,首次揭示了HSFs也参与到植物PCD的调控过程。该结论有以下研究结果支持:(a)活细胞和核染色实验证实,与野生型(Wild type,WT)原生质体相比,热激(40℃10 min)后,HsfA2T-DNA插入突变体(hsfA2)的细胞活力水平显著低于WT的；hsfA2的核浓缩现象更为明显；(b)荧光共振能量转移技术(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)实验证实,热激后,hsfA2单个活细胞水平上的类caspase-3激活要比WT的更早,酶活性持续时间更久；群体水平上的in vitro实验进一步证实,hsfA2的类caspase-3酶活性要显著高于WT的；(c)定量统计结果表明,热激导致hsfA2体内产生的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平显著高于WT的；(d)亚细胞定位结果显示,ROS在hsfA2原生质体上首先产生在线粒体(热激后30min),随后在叶绿体处也有大量积累(热激后1 h),而WT内的ROS只在线粒体处产生；(e)外源抗坏血酸(Ascorbic acid,ASA)或过氧化氢酶(Catalase,CAT)能有效抑制热激诱导的WT体内ROS的产生和和随后的细胞死亡,但却只能部分抑制热激诱导的hsfA2体内ROS产生和随后的细胞死亡；(f)HsfA2的缺失导致严重的线粒体动力学(线粒体运动和形态分布)改变；(g)热激诱导了hsfA2体内比WT更快速的线粒体膜电位(Mitochondrial transmembrane potential,MTP)下降；(h)热激导致hsfA2体内抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)活性比WT的更低；(i)以上hsfA2和WT间的各种差异可被在hsfA2体内重新导入HsfA2基因后所弥补。
总之,HsfA2的缺失,使ROS在线粒体和叶绿体处都有积累,可能的原因是HsfA2突变体胞内抗坏血酸过氧化物酶活性较低；随后的时间,线粒体形态和动力学发生改变,线粒体膜电位下降,类caspase-3开始激活,表明热激诱导的PCD是线粒体信号通路依赖的；外源ROS清除剂能有效抑制ROS生成并能抑制热激诱导的PCD,证明ROS参与了PCD的调控过程:hsfA2和WT不但在ROS水平上表现出显著差异,而且在线粒体损伤、类caspase-3活性以及细胞活力上,二者也表现出极大的不同；但是,hsfA2表现出的严重的线粒体损伤、较高的类caspase-3活性以及较低的细胞活力,能被重新导入HsfA2基因而恢复到WT水平,证实HsfA2在热激诱导的植物PCD进程中起重要调节作用。
总结以上,本文借助生物光子学前沿技术,深入开展了热激诱导植物PCD的分子调控机制和信号通路研究,可视化分析了氧化还原失衡及亚细胞器官功能紊乱是热激诱导PCD的早期事件,探索了热激条件下HSFs在植物PCD中的作用,首次揭示了拟南芥HsfA2以调节胞内氧化还原平衡的方式,来调控热激诱导的线粒体途径依赖的植物PCD,这对于植物逆境适应机制及与环境互作方式、PCD调控信号通路的解明具有重要科学意义,同时也为生物光子学技术在其他领域的应用研究提供了一定的理论和实验基础。