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本文建立了体外大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞自然退变模型，筛选该软骨细胞中稳定表达的PTKs及PTPs；分析了PTK、PTP对软骨细胞的作用；进一步以益气化瘀方及拆方益气方、化瘀方含药血清干预自然退变软骨细胞体系探讨了益气化瘀中药对大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞PTK、PTP及细胞外基质(ECM)的调节效应，并分析了其对椎间盘软骨细胞信号转导途径的调控作用，探讨了中药延缓椎间盘退变(IVDD)及治疗椎间盘退变性疾病的机理。
方法使用酶消化法建立体外大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞自然退变模型；并以倒置相差显微镜及电子显微镜观察、HE及甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化等不同方法对其进行鉴定；采用MTT法对软骨细胞增殖率变化进行检测，并对益气化瘀方及拆方(益气方、化瘀方)和对照方(补肾方、通络方)作用软骨细胞的最佳血药浓度进行筛选；运用RT-PCR法进行软骨细胞中PTKs/PTPs筛选并对其Ⅱ、Ⅸ型胶原和AggrecanmRNA表达进行半定量检测；采用QRT-PCR(实时定量PCR)法对PTK及PTPmRNA进行定量检测；数据均以(-x±s)表示，应用SPSS10.0统计软件包进行方差分析，Excell2000进行统计图分析；综合探讨益气化瘀方及拆方等药理血清对椎间盘软骨细胞PTK、PTP的作用效应，及其对软骨细胞Ras-MAPK和JAK-STATs信号转导通路及其串话调控的相关过程和机理。
结果建立了大鼠体外椎间盘软骨细胞自然退变模型。经筛选得知IGFR及PTPn1椎间盘软骨细胞中有着稳定的表达。各酶抑制剂作用于软骨细胞7d后，分别可见：Genistein明显抑制IGFR(PTK酶家族关键成员)及Ⅱ型胶原mRNA表达并抑制细胞增殖、CalyculinA抑制其Ⅸ型胶原和AggrecanmRNA表达、Na3Vo4则明显抑制其PTPn1mRNA(PTP酶家族关键成员)和AggrecanmRNA表达且明显抑制细胞增殖。益气化瘀方含药血清直接作用48h后，可明显上调退变软骨细胞中IGFR、Ⅱ、Ⅸ型胶原及AggrecanmRNA表达，下调PTPn1mRNA的表达，并促进其细胞增殖；益气方则下调其Ⅱ型胶原mRNA表达，对细胞增殖率无明显影响；化瘀方则可抑制细胞增殖；补肾方亦可上调其IGFR、Ⅱ型胶原及AggrecanmRNA表达，下调PTPn1mRNA表达；通络方则可上调AggrecanmRNA表达。抑制剂作用7d后，继以含药血清作用48h，结果表明，在Genistein加入组、CalyculinA加入组及Na3Vo4加入组，益气化瘀方含药血清均可明显上调IGFR、Ⅱ、Ⅸ型胶原及AggrecanmRNA表达，下调PTPn1mRNA的表达，并促进其细胞增殖；益气方含药血清在Genistein加入组可上调Ⅱ型胶原mRNA表达并促进其细胞增殖，在CalyculinA加入组可下调其AggrecanmRNA表达；补肾方在Genistein加入组及CalyculinA加入组均可上调Ⅸ型胶原mRNA表达，下调PTPn1mRNA的表达；通络方在Genistein加入组则可下调其AggrecanmRNA表达。析因分析结果表明，益气方与化瘀方有交互作用，在IGFR、PTPn1mRNA及Ⅱ、Ⅸ型胶原及AggrecanmRNA表达及软骨细胞增殖率的调节方面，存在协同作用。
结论本课题建立了椎间盘软骨终板软骨细胞体外自然退变模型，为进一步深入研究益气化瘀中药延缓椎间盘退变的机理提供了载体；系统筛选了与上述软骨细胞自然退变密切相关的信号转导通路中的关键酶PTKs及PTPs，使有针对性地研究益气化瘀中药延缓或抑制椎间盘软骨终板退变的靶点和作用机理成为可能；并证实：IGFR及PTPn1在椎间盘软骨细胞增殖、胶原形成、Aggrecan表达以及软骨细胞内外信号转导等诸多方面发挥重要作用；而益气化瘀方及拆方益气方、化瘀方可以通过上调IGFRmRNA表达、下调PTPn1mRNA表达，参与调控Ras-MAPK及JAK-STATs等重要信号转导通路，调控椎间盘细胞内外信号转导过程，从而促进体外自然退变椎间盘软骨终板软骨细胞增殖率、促进其Ⅱ、Ⅸ型胶原及Aggrecan等细胞外基质的mRNA表达，改善软骨细胞功能，最终达到延缓IVDD的目的；拆方研究证实益气化瘀方延缓椎间盘退变有赖于益气与化瘀二法的有机结合，有效配伍才能发挥最佳效应。本课题从“益气化瘀”角度对中医气血理论与信号转导的关系进行了有益探讨，并为中医“气虚血瘀”理论在椎间盘退变中的物质基础研究提供了方向。