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家蚕是一种具有重要经济价值的完全变态昆虫，同时也是鳞翅目的模式昆虫，在其短暂的一生中需要经历卵、幼虫、蛹以及成虫四个不同的阶段。家蚕的丝腺可以合成和分泌出一种天然高分子蛋白纤维——蚕丝。蚕丝具有优良的性能，不仅可以用作纺织服装材料，随着现代技术的发展还可以应用于医药、美容、航天材料等领域。
家蚕的祖先是野桑蚕，至今已经被驯化超过5000年。各种出土文物、历史文献以及现代分子生物学的分子证据都证明，家蚕起源于中国，并扩散到世界各地的。在经过几千年的人工选择以后，家蚕相对于野桑蚕产生了很多差异，比如体色、幼虫的体型大小、生长周期和蛾子的飞行能力等方面的差异。蚕丝在过去主要是被用作丝绸服装，因此提高蚕丝产量成了人们驯化和筛选的主要目的。而丝腺作为合成和分泌蚕丝的唯一器官，其在驯化过程中必定遭受了更多更强烈的人工选择压力。
丝腺大致可以分为前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺三个部分。中部丝腺分泌丝胶蛋白，后部丝腺主要分泌丝素蛋白包括丝素重链蛋白、丝素轻链蛋白以及P25蛋白。蚕丝纤维是由内层的丝素蛋白和外层的丝胶蛋白包裹形成。目前已有大量研究聚焦于家蚕丝腺的结构和功能，但是关于家蚕和野桑蚕丝腺以及蚕茧的相关差异和驯化机制的研究还相对薄弱。本研究从家蚕和野桑蚕蚕茧差异分析入手，并选择合适时间点进行丝腺转录组的差异表达分析，筛选出相关的差异表达基因，最后通过人工调控的方法验证筛选出的差异表达基因的功能。主要研究结果如下：
1、家蚕和野桑蚕蚕茧相关差异分析
为探究家蚕和野桑蚕在蚕丝产量以外的其他差异，我们将获得的家蚕大造品种蚕茧(B.mori)以及北碚野桑蚕蚕茧(B.man)进行扫描电镜分析、力学性能分析以及溶解度分析。通过扫描电镜观察，发现野桑蚕蚕丝表面有更多的草酸钙结晶，家蚕蚕茧茧层之间相对更加疏松，而野桑蚕蚕茧茧层更加致密，紧紧的贴在一起。而对于蚕丝直径的分析，结果显示两者之间并没有明显的差别。
随后对两种蚕丝的力学性能进行比较，结果分析显示野桑蚕蚕丝力学性能要优于家蚕蚕丝。两者在延展性上没有很明显的差别，但是在最大应力上野桑蚕蚕丝要显著优于家蚕蚕丝。此外，对两种蚕茧的溶解能力的分析发现，家蚕蚕茧可以很快的完全溶解在LiSCN溶液中，而野桑蚕蚕茧却有很大一部分都很难溶解。
通过二者的比较分析中发现，家蚕蚕茧除了颜色、大小与野桑蚕蚕茧有差异以外，蚕茧的致密性、疏松度、茧丝力学性能以及蚕茧的溶解度都有很大的差异。
2、家蚕和野桑蚕丝腺转录组分析
本部分研究首先对上蔟前的家蚕和野桑蚕的中部丝腺和后部丝腺进行RNA提取,并进行二代转录组测序。通过转录组测序共获得有注释的Unigene为20268个。差异表达分析显示在中部丝腺差异表达的Unigene为9752个，其中野桑蚕中上调表达的基因有3074个，家蚕中上调的基因有6678个。在后部丝腺中差异表达的Unigene有8207个，其中在野桑蚕中上调表达的有2052个，在家蚕中上调表达的基因为6155个。我们发现不论是在中部丝腺还是后部丝腺，上调表达的基因主要集中在家蚕中。
为更进一步地探索这些差异表达基因行使的功能，我们进行差异表达基因的GO分类富集分析。我们发现不论是在中部丝腺还是后部丝腺，有大部分的差异表达基因都显著性的富集到催化活性上，揭示家蚕和野桑蚕在丝蛋白合成和分泌方面有很大的差异。此外，还发现许多差异表达基因注释为酶类，暗示丝蛋白在后期分泌和加工上存在着差异，可能使丝蛋白的结构发生了变化。此外，对差异表达基因进行KEGG通路分析，结果显示不论是中部丝腺还是后部丝腺的差异表达基因，都涉及到蛋白的合成与转运以及氨基酸的代谢、能量代谢等，说明家蚕和野桑蚕丝腺在蛋白合成和利用上有很大的差异，暗示两种蚕在产丝能力上有很大的差异。
进一步的分析，我们发现基因CL1003.Contig2_All(BGIBMGA003330)在家蚕和野桑蚕的中部丝腺和后部丝腺都存在差异表达，其在野桑蚕丝腺中的表达量要高于家蚕丝腺。通过共表达网络分析，我们发现该基因在后部丝腺只与丝素重链基因(Fib-H)有共表达的相关性。BGIBMGA003330基因注释为尿苷-肌苷核苷水解酶，可以将尿苷分解为尿嘧啶和核糖，对嘧啶核苷酸的生成和利用起着重要作用，参与了生物体的生长发育。因此，推测该基因可能影响丝腺的生长发育以及丝蛋白的分泌和合成。
3、家蚕BmE细胞系的CRISPRa和CRISPRi系统的构建
为验证筛选出的基因的功能，我们首先在家蚕BmE细胞系中构建了基于CRISPRa和CRISPRi的基因激活和基因抑制调控系统。在CRISPRa激活系统中，我们构建了dCas9-VP64和dCas9-VPR两个激活载体。我们首先证明两个激活载体都可以高效地激活目的基因的表达，并且进一步的分析发现dCas9-VPR要比dCas9-VP64的效率高很多。dCas9-VPR系统可以高效地激活目的基因并且不会引起脱靶效应，且其可以同时激活三个目的基因的表达，证明其可以用于多基因的同时激活表达。此外，还发现dCas9-VPR对于每个基因的激活能力并不相同。对于表达量越低的基因其激活效果更明显，对于具有一定表达量的基因，其激活能力要相对的减弱，呈现一种负相关的形式。
在CRISPRi抑制系统中，一共选取5个不同的转录因子进行载体构建包括：KRAB、SRDX、ERD、hairy和SID。首先，我们证实这5个不同的抑制系统都可以特异高效地引起目的基因的下调表达，显著性分析发现这5个不同的载体其抑制效果并没有显著性的差异。随后，我们也证明了CRISPRi系统可以应用于多基因的同时下调。同时还发现两个影响抑制效率的因素，其中之一是sgRNA与转录起始位点(TSS)的距离会影响抑制效率，距离转录起始位点越近，抑制效率越好；另外一个就是转染细胞时dCas9与sgRNA的转录浓度也会影响抑制效率，在本研究所进行的实验中浓度比为1:4的时候效果最好。
本研究的结果证实CRISPRa和CRISPRi系统是一种快速的、可应用于家蚕甚至鳞翅目昆虫基因功能研究的方法，同时也为该系统在家蚕个体中的成功应用提供了可行性。
4、通过CRISPRa、CRISPRi或者CRISPR敲除转基因家蚕品系验证差异表达基因功能
本部分中首先成功构建了基于piggyBac转座子的家蚕转基因个体上的CRISPRa和CRISPRi系统，包括家蚕后部丝腺FibH启动子启动的CRISPRa和CRISPRi，分别是pBac-FibH-dCas9-VPR和pBac-FibH-dCas9-ERD，以及家蚕中部丝腺Ser1启动子启动的CRISPRa和CRISPRi系统，分别是pBac-Ser1-dCas9-VPR和pBac-Ser1-dCas9-ERD。此外，根据sgRNA设计原则我们对每个筛选出来的差异表达基因分别设计不同位置的3对sgRNA，将所有的sgRNA组成sgRNA文库，并于家蚕蚕卵中进行混合注射。
我们首先从sgRNA转基因系混合库个体中筛选出含有BGIBMGA003330基因的sgRNA转基因阳性个体，并将其分别与pBac-FibH-dCas9-VPR(CRISPRa转基因品系)、pBac-FibH-dCas9-ERD(CRISPRi转基因品系)以及已有的pBac-NaNos-Cas9(CRISPR敲除转基因品系)转基因阳性个体进行杂交，并筛选阳性个体后代。qRT-PCR检测转基因杂交后代幼虫5龄3天BGIBMGA003330基因的表达量，结果显示CRISPRa转基因品系与BGIBMGA003330基因sgRNA的转基因品系杂交后的个体其基因表达量与对照相比有显著的升高，且雌性转基因后代的茧重和茧层率有显著增加。同时我们检测了pBac-NaNos-Cas9在BGIBMGA003330基因启动子敲除后的杂交后代，PCR测序发现其在sgRNA位点处成功进行了敲除。随后我们检测敲除个体5龄3天该基因的表达量，发现敲除个体该基因的表达量要显著的低于对照组，证明Nanos-Cas9可以成功在BGIBMGA003330基因的启动子处进行敲除，并导致基因表达量的下调。随后，对敲除个体的蚕茧进行性状分析。结果显示敲除个体的蚕茧茧重、蛹重以及茧层率相对于对照组都明显的下降。qRT-PCR检测敲除个体后部丝腺FibH的表达量，结果显示相对于对照组有明显的下降，但是FibL和P25表达水平没有明显的差别。这说明BGIBMGA003330基因敲除后引起基因表达量下降，对丝蛋白的合成和分泌会有一定的影响。为了更进一步探索该基因表达量下调后对蚕丝性能是否有影响，我们检测敲除个体的茧丝力学性能，结果显示BGIBMGA003330基因表达量下调后不会影响蚕丝的力学性能。
除此之外，本研究中还筛选得到其他一些gRNA转基因个体与CRISPRa或者CRISPRi品系杂交的转基因阳性个体，例如BGIBMGA009814基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其sgRNA转基因系与pBac-FibH-dCas9-VPR转基因个体杂交后，qRT-PCR检测5龄3天转基因个体后部丝腺该基因的表达量与对照组相比有显著的提升，证明CRISPRa系统在家蚕中可以成功实现目的基因的上调。随后对转基因阳性个体的蚕茧茧重、蛹重以及茧层率进行测定，发现BGIBMGA009814基因上调以后不会影响其后代蚕茧的相关性状。但是在对其蚕茧进行扫描电镜观察时发现，阳性个体的蚕茧茧层出现更致密的情况，这一点与野桑蚕蚕茧更加相似。
综上所述，本研究从家蚕和野桑蚕蚕茧差异分析出发，通过丝腺转录组的差异比较筛选出可能与其相关的差异表达基因。并且在个体水平上构建适用于家蚕的CRISPRa激活系统和CRISPRi抑制系统，为家蚕基因功能的研究提供新的方法。同时证实BGIBMGA003330基因与家蚕的蚕丝产量有关，暗示其可能是家蚕选择驯化相关的基因。本研究也为了解家蚕的驯化机制以及蚕丝蛋白合成分泌提供分子基础，甚至为蚕丝的品质改良提供新的思路和方法。
家蚕的祖先是野桑蚕，至今已经被驯化超过5000年。各种出土文物、历史文献以及现代分子生物学的分子证据都证明，家蚕起源于中国，并扩散到世界各地的。在经过几千年的人工选择以后，家蚕相对于野桑蚕产生了很多差异，比如体色、幼虫的体型大小、生长周期和蛾子的飞行能力等方面的差异。蚕丝在过去主要是被用作丝绸服装，因此提高蚕丝产量成了人们驯化和筛选的主要目的。而丝腺作为合成和分泌蚕丝的唯一器官，其在驯化过程中必定遭受了更多更强烈的人工选择压力。
丝腺大致可以分为前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺三个部分。中部丝腺分泌丝胶蛋白，后部丝腺主要分泌丝素蛋白包括丝素重链蛋白、丝素轻链蛋白以及P25蛋白。蚕丝纤维是由内层的丝素蛋白和外层的丝胶蛋白包裹形成。目前已有大量研究聚焦于家蚕丝腺的结构和功能，但是关于家蚕和野桑蚕丝腺以及蚕茧的相关差异和驯化机制的研究还相对薄弱。本研究从家蚕和野桑蚕蚕茧差异分析入手，并选择合适时间点进行丝腺转录组的差异表达分析，筛选出相关的差异表达基因，最后通过人工调控的方法验证筛选出的差异表达基因的功能。主要研究结果如下：
1、家蚕和野桑蚕蚕茧相关差异分析
为探究家蚕和野桑蚕在蚕丝产量以外的其他差异，我们将获得的家蚕大造品种蚕茧(B.mori)以及北碚野桑蚕蚕茧(B.man)进行扫描电镜分析、力学性能分析以及溶解度分析。通过扫描电镜观察，发现野桑蚕蚕丝表面有更多的草酸钙结晶，家蚕蚕茧茧层之间相对更加疏松，而野桑蚕蚕茧茧层更加致密，紧紧的贴在一起。而对于蚕丝直径的分析，结果显示两者之间并没有明显的差别。
随后对两种蚕丝的力学性能进行比较，结果分析显示野桑蚕蚕丝力学性能要优于家蚕蚕丝。两者在延展性上没有很明显的差别，但是在最大应力上野桑蚕蚕丝要显著优于家蚕蚕丝。此外，对两种蚕茧的溶解能力的分析发现，家蚕蚕茧可以很快的完全溶解在LiSCN溶液中，而野桑蚕蚕茧却有很大一部分都很难溶解。
通过二者的比较分析中发现，家蚕蚕茧除了颜色、大小与野桑蚕蚕茧有差异以外，蚕茧的致密性、疏松度、茧丝力学性能以及蚕茧的溶解度都有很大的差异。
2、家蚕和野桑蚕丝腺转录组分析
本部分研究首先对上蔟前的家蚕和野桑蚕的中部丝腺和后部丝腺进行RNA提取,并进行二代转录组测序。通过转录组测序共获得有注释的Unigene为20268个。差异表达分析显示在中部丝腺差异表达的Unigene为9752个，其中野桑蚕中上调表达的基因有3074个，家蚕中上调的基因有6678个。在后部丝腺中差异表达的Unigene有8207个，其中在野桑蚕中上调表达的有2052个，在家蚕中上调表达的基因为6155个。我们发现不论是在中部丝腺还是后部丝腺，上调表达的基因主要集中在家蚕中。
为更进一步地探索这些差异表达基因行使的功能，我们进行差异表达基因的GO分类富集分析。我们发现不论是在中部丝腺还是后部丝腺，有大部分的差异表达基因都显著性的富集到催化活性上，揭示家蚕和野桑蚕在丝蛋白合成和分泌方面有很大的差异。此外，还发现许多差异表达基因注释为酶类，暗示丝蛋白在后期分泌和加工上存在着差异，可能使丝蛋白的结构发生了变化。此外，对差异表达基因进行KEGG通路分析，结果显示不论是中部丝腺还是后部丝腺的差异表达基因，都涉及到蛋白的合成与转运以及氨基酸的代谢、能量代谢等，说明家蚕和野桑蚕丝腺在蛋白合成和利用上有很大的差异，暗示两种蚕在产丝能力上有很大的差异。
进一步的分析，我们发现基因CL1003.Contig2_All(BGIBMGA003330)在家蚕和野桑蚕的中部丝腺和后部丝腺都存在差异表达，其在野桑蚕丝腺中的表达量要高于家蚕丝腺。通过共表达网络分析，我们发现该基因在后部丝腺只与丝素重链基因(Fib-H)有共表达的相关性。BGIBMGA003330基因注释为尿苷-肌苷核苷水解酶，可以将尿苷分解为尿嘧啶和核糖，对嘧啶核苷酸的生成和利用起着重要作用，参与了生物体的生长发育。因此，推测该基因可能影响丝腺的生长发育以及丝蛋白的分泌和合成。
3、家蚕BmE细胞系的CRISPRa和CRISPRi系统的构建
为验证筛选出的基因的功能，我们首先在家蚕BmE细胞系中构建了基于CRISPRa和CRISPRi的基因激活和基因抑制调控系统。在CRISPRa激活系统中，我们构建了dCas9-VP64和dCas9-VPR两个激活载体。我们首先证明两个激活载体都可以高效地激活目的基因的表达，并且进一步的分析发现dCas9-VPR要比dCas9-VP64的效率高很多。dCas9-VPR系统可以高效地激活目的基因并且不会引起脱靶效应，且其可以同时激活三个目的基因的表达，证明其可以用于多基因的同时激活表达。此外，还发现dCas9-VPR对于每个基因的激活能力并不相同。对于表达量越低的基因其激活效果更明显，对于具有一定表达量的基因，其激活能力要相对的减弱，呈现一种负相关的形式。
在CRISPRi抑制系统中，一共选取5个不同的转录因子进行载体构建包括：KRAB、SRDX、ERD、hairy和SID。首先，我们证实这5个不同的抑制系统都可以特异高效地引起目的基因的下调表达，显著性分析发现这5个不同的载体其抑制效果并没有显著性的差异。随后，我们也证明了CRISPRi系统可以应用于多基因的同时下调。同时还发现两个影响抑制效率的因素，其中之一是sgRNA与转录起始位点(TSS)的距离会影响抑制效率，距离转录起始位点越近，抑制效率越好；另外一个就是转染细胞时dCas9与sgRNA的转录浓度也会影响抑制效率，在本研究所进行的实验中浓度比为1:4的时候效果最好。
本研究的结果证实CRISPRa和CRISPRi系统是一种快速的、可应用于家蚕甚至鳞翅目昆虫基因功能研究的方法，同时也为该系统在家蚕个体中的成功应用提供了可行性。
4、通过CRISPRa、CRISPRi或者CRISPR敲除转基因家蚕品系验证差异表达基因功能
本部分中首先成功构建了基于piggyBac转座子的家蚕转基因个体上的CRISPRa和CRISPRi系统，包括家蚕后部丝腺FibH启动子启动的CRISPRa和CRISPRi，分别是pBac-FibH-dCas9-VPR和pBac-FibH-dCas9-ERD，以及家蚕中部丝腺Ser1启动子启动的CRISPRa和CRISPRi系统，分别是pBac-Ser1-dCas9-VPR和pBac-Ser1-dCas9-ERD。此外，根据sgRNA设计原则我们对每个筛选出来的差异表达基因分别设计不同位置的3对sgRNA，将所有的sgRNA组成sgRNA文库，并于家蚕蚕卵中进行混合注射。
我们首先从sgRNA转基因系混合库个体中筛选出含有BGIBMGA003330基因的sgRNA转基因阳性个体，并将其分别与pBac-FibH-dCas9-VPR(CRISPRa转基因品系)、pBac-FibH-dCas9-ERD(CRISPRi转基因品系)以及已有的pBac-NaNos-Cas9(CRISPR敲除转基因品系)转基因阳性个体进行杂交，并筛选阳性个体后代。qRT-PCR检测转基因杂交后代幼虫5龄3天BGIBMGA003330基因的表达量，结果显示CRISPRa转基因品系与BGIBMGA003330基因sgRNA的转基因品系杂交后的个体其基因表达量与对照相比有显著的升高，且雌性转基因后代的茧重和茧层率有显著增加。同时我们检测了pBac-NaNos-Cas9在BGIBMGA003330基因启动子敲除后的杂交后代，PCR测序发现其在sgRNA位点处成功进行了敲除。随后我们检测敲除个体5龄3天该基因的表达量，发现敲除个体该基因的表达量要显著的低于对照组，证明Nanos-Cas9可以成功在BGIBMGA003330基因的启动子处进行敲除，并导致基因表达量的下调。随后，对敲除个体的蚕茧进行性状分析。结果显示敲除个体的蚕茧茧重、蛹重以及茧层率相对于对照组都明显的下降。qRT-PCR检测敲除个体后部丝腺FibH的表达量，结果显示相对于对照组有明显的下降，但是FibL和P25表达水平没有明显的差别。这说明BGIBMGA003330基因敲除后引起基因表达量下降，对丝蛋白的合成和分泌会有一定的影响。为了更进一步探索该基因表达量下调后对蚕丝性能是否有影响，我们检测敲除个体的茧丝力学性能，结果显示BGIBMGA003330基因表达量下调后不会影响蚕丝的力学性能。
除此之外，本研究中还筛选得到其他一些gRNA转基因个体与CRISPRa或者CRISPRi品系杂交的转基因阳性个体，例如BGIBMGA009814基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其sgRNA转基因系与pBac-FibH-dCas9-VPR转基因个体杂交后，qRT-PCR检测5龄3天转基因个体后部丝腺该基因的表达量与对照组相比有显著的提升，证明CRISPRa系统在家蚕中可以成功实现目的基因的上调。随后对转基因阳性个体的蚕茧茧重、蛹重以及茧层率进行测定，发现BGIBMGA009814基因上调以后不会影响其后代蚕茧的相关性状。但是在对其蚕茧进行扫描电镜观察时发现，阳性个体的蚕茧茧层出现更致密的情况，这一点与野桑蚕蚕茧更加相似。
综上所述，本研究从家蚕和野桑蚕蚕茧差异分析出发，通过丝腺转录组的差异比较筛选出可能与其相关的差异表达基因。并且在个体水平上构建适用于家蚕的CRISPRa激活系统和CRISPRi抑制系统，为家蚕基因功能的研究提供新的方法。同时证实BGIBMGA003330基因与家蚕的蚕丝产量有关，暗示其可能是家蚕选择驯化相关的基因。本研究也为了解家蚕的驯化机制以及蚕丝蛋白合成分泌提供分子基础，甚至为蚕丝的品质改良提供新的思路和方法。