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经过几千年的人工驯化，家蚕(Bombyx mori)成为了一种具有重要经济价值的昆虫。蚕丝是家蚕主要的经济产物，因此蚕丝产量的多少决定了家蚕经济价值的高低。业界内通常用茧层率(茧层重/茧重)来衡量蚕丝产量的高低，家蚕的茧层率越高，相对的丝蛋白量就越多，其经济价值也就越大。所以茧层率便成为育种者关注的主要性状。经过长期的人工选育，家蚕的茧层率从10%提高到约25%。然而传统选育手段的局限性，导致家蚕的茧层率难以进一步提高。为了提高茧层率，增加家蚕经济价值，就必须打破传统育种方法，结合新兴技术寻找突破口。
提高茧层率的实质就是增加丝蛋白的相对合成量，可以从两个方面进行思考：延长丝蛋白合成的时间、增强丝蛋白合成的效率。延长丝蛋白合成的时间，实际是通过延长幼虫生长周期来达到目的，这将会增加桑叶的消耗和人力的投入，从产业的角度来看，实际的收益并未明显增加。所以我们将关注点放到了提高丝蛋白合成效率上。首先，蛋白质的翻译需要以氨基酸作为原料，当氨基酸原料增多时，能够一定程度的增加蛋白质的合成量。因此，增加丝蛋白合成的氨基酸原料是提高丝蛋白合成效率的潜在手段。经过前期的分析，我们发现丝蛋白合成所需要的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸)是重要的突破口，三种氨基酸占丝素蛋白组分的85%以上。值得注意的是，甘氨酸占丝素蛋白组分的45.9%，是丝蛋白合成的主要氨基酸原料，同时甘氨酸可以通过转氨和脱氨作用转变为丝氨酸和丙氨酸。利用氨基酸转运体将血淋巴中的甘氨酸转运到丝腺细胞内，从而增加丝蛋白合成的氨基酸原料，最终可能达到增加丝蛋白合成量且获得高茧层率家蚕品系的目的。其次，在蛋白质翻译过程中，mTORC1信号通路发挥了重要的调节功能，它响应机体的氨基酸营养信号，调节蛋白质的翻译合成。一头蚕一生食下20g的桑叶，合成0.5g的蚕丝蛋白，其丝腺内部蛋白质的合成十分旺盛，所以丝腺也被视为一个蛋白质生产工厂。从5龄期开始，家蚕幼虫的食桑量急剧增加，血淋巴中营养物质(尤其是氨基酸)明显增多，丝蛋白大量合成且丝腺迅速增大。我们推测，这个时期氨基酸营养信号可能通过mTORC1信号通路参与丝蛋白的合成调控，因此我们想进一步探究氨基酸营养信号、mTORC1信号通路、家蚕丝蛋白三者之间的关系，并期许利用氨基酸转运体调节丝腺内的mTORC1信号，增强丝腺细胞的蛋白翻译效率，提高家蚕丝蛋白的合成能力。
鉴于此，本研究采用生物信息学和分子生物学中的多种技术手段，在蛋白质翻译过程，研究丝蛋白合成所需要主要氨基酸(甘氨酸)和mTORC1信号通路对丝蛋白合成效率的影响。利用遗传操作改变丝腺中氨基酸(甘氨酸)的水平以及调节mTORC1信号的激活，增加了丝蛋白合成的效率，获得了三个吐丝量和茧层率显著提高的转基因家蚕品系。此外，利用转基因技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术，证明BmSLC7A5通过调节5龄期丝腺中的亮氨酸含量，调控mTORC1信号的激活，从而控制丝蛋白及相关转录因子的合成。本研究结果如下：
1.家蚕SLC6/7基因家族成员的鉴定及进化关系、表达特征分析
基于丝蛋白合成所需要的主要氨基酸(甘氨酸)和mTORC1信号通路，我们分别筛选出了参与甘氨酸转运和mTORC1信号通路激活的两个溶质载体基因家族，即溶质载体基因家族6/7。首先，我们对家蚕SLC6家族进行了全基因组的鉴定，并对这些基因的保守性、进化关系、表达模式、潜在生理功能进行了初步的分析，结果发现在家蚕基因组中总共有16个SLC6家族成员。昆虫的SLC6家族主要分为五个亚家族：NATs、AATs、INE、NTTs、Orphan，而家蚕SLC6家族成员在五个亚家族均有分布。组织表达谱显示，BmNAT1、BmNAT2、BmGT1-L、BmSLC6-15、BmINE、BmGT1基因主要在家蚕的中肠表达。时期表达谱显示，中肠高量表达的基因在5龄盛食期持续表达可能参与营养氨基酸的吸收，而脑部高量表达的BmGAT1、BmGT2、BmDAT、BmSERT、BmB(0)AT3-1、BmB(0)AT3-2基因可能参与家蚕的上蔟和交配行为。
其次，通过同源序列比对，我们在家蚕基因组中总共鉴定到了12个SLC7家族成员。对所有成员的序列相似性和进化关系进行分析，发现与其他物种相似，家蚕SLC7家族的成员主要被划分为两个亚家族，分别为CATs和HATs。此外，在表达模式上SLC7家族成员具有广泛的组织分布，多个基因在马氏管中高量表达。而BmSLC7A5基因在家蚕的丝腺中高量表达，我们推测由于表达位置的差异，BmSLC7A5基因应该有着不同于该家族其他成员的生理功能。
2.家蚕BmGT1-L基因的功能研究及利用
由于本部分研究主要关注丝蛋白合成所需的氨基酸原料(甘氨酸)，所以将上一章筛选出的甘氨酸转运蛋白作为研究靶标。在家蚕SLC6家族中，有三个甘氨酸转运蛋白，其中BmGT1-L在中肠特异且高量表达，可能在甘氨酸的吸收利用过程中发挥重要作用，因此我们选择BmGT1-L基因进行后续研究。利用RT-PCR、Q-PCR、Westernblotting等方法，在转录水平和蛋白水平对BmGT1-L进行表达特征的检测，并对其进行组织免疫荧光定位分析。结果发现，BmGT1-L在转录和蛋白水平都在家蚕中肠特异表达。免疫荧光定位显示，BmGT1-L蛋白表达于中肠上皮细胞特化形成的微绒毛上，推测其可能参与微绒毛对营养物质的吸收。BmGT1-L基因表达水平在起蚕期明显高于眠期，推测该基因可能受到食物或保幼激素的诱导。为了进一步验证上述推测，对家蚕个体和离体中肠分别进行了饥饿处理和JHA诱导。结果显示，BmGT1-L基因的表达会受到食物和保幼激素的诱导。此外，通过抑制剂处理，间接证明了BmGT1-L蛋白具有甘氨酸转运能力。这些结果表明，家蚕中肠高量表达的BmGT1-L可能参与肠道内甘氨酸的吸收转运。综上所述，BmGT1-L具有的甘氨酸转运能力，能作为增加丝腺内部甘氨酸水平的分子靶标。
为了验证增加丝蛋白合成所需的氨基酸原料是否能提高丝蛋白的合成量，我们以BmGT1-L为靶标，利用后部丝腺特异表达的BmFibH基因的启动子和BmGT1-L基因CDS序列，构建piggyBac[3×P3-Red，BmFibhP-BmGT1-L]转基因重组载体，并获得了后部丝腺异位表达BmGT1-L基因的转基因家蚕。结果显示，转基因家蚕丝蛋白合成量显著提高，其吐丝量(茧层重)增加了11%、茧层率提高了1个百分点，其经济性状得到了较明显的提高。分子检测表明，后部丝腺中BmGT1-L的异位表达促进了甘氨酸的生物合成，并通过增加丝素蛋白的合成提高家蚕的吐丝量。本部分研究结果将促进对BmGT1-L功能的认识，并从增加丝蛋白合成所需氨基酸的角度为提高蚕丝产量提供新的思路。
3.mTORC1信号通路调节家蚕丝蛋白合成
本部分研究，将焦点集中于丝蛋白合成的翻译调控上，我们分析了蛋白质翻译过程中的诸多影响因素。结果发现，在蛋白质翻译过程中，mTORC1信号通路够响应氨基酸营养信号，调控蛋白质的合成。因此，mTORC1信号通路与家蚕丝蛋白合成是否有关就值得深入探究。首先，利用rapamycin抑制剂，我们在体内和体外分别处理了丝腺。结果发现，处理组mTORC1信号通路靶蛋白4EBP和S6K磷酸化水平明显降低，同时丝蛋白基因(BmFibH、BmFibL、BmP25)及相关转录因子(Bmdimm、BmSGF1)的表达被显著的抑制，丝蛋白的合成量也明显减少。与对照相比，抑制剂处理组丝腺的体积减小，茧的尺寸变小，吐丝量(茧层重)降低45%，茧层率降低7.3个百分点，但是蛹的重量增加了21%。其次，为了正向验证mTORC1信号通路对丝蛋白合成的调控，我们利用转基因技术在家蚕后部丝腺过量表达了能够直接激活mTORC1的BmRheb基因。BmRheb增量表达后，丝腺内4EBP和S6K磷酸化水平明显增加，同时丝蛋白(BmFibH、BmFibL、BmP25)及相关转录因子(Bmdimm、BmSage)的表达上调，丝蛋白的合成量也明显增加。此外，蚕茧和丝腺的大小显著的变大，其吐丝量(茧层重)增加了16%、茧层率提高了1.5个百分点。总的来说，mTORC1信号通路能够明显的影响丝蛋白的合成。
4.BmSLC7A5介导亮氨酸-mTORC1信号调节丝蛋白合成
为了进一步解析mTORC1信号通路在丝腺中调节丝蛋白合成的分子机制，我们进行了深入的分析。在其他物种中，SLC7A5被报道参与mTORC1信号通路的激活，而我们前期的研究发现，BmSLC7A5基因在丝腺中高量表达，这暗示着该基因可能通过mTORC1信号通路调节丝蛋白合成。所以，我们选取家蚕丝腺高量表达的BmSLC7A5基因开展了后续的研究。首先，对BmSLC7A5进行了组织表达特征检测以及免疫荧光定位分析。结果显示，该基因在丝腺、中肠、脂肪体高量表达，其中丝腺内的相对表达量最高，且主要定位于丝腺细胞质和细胞膜。在整个5龄期，BmSLC7A5在5龄前3天表达较高，随后开始下降，而后部丝腺中的亮氨酸含量也是在5龄前3天较高，随后减少。从变化趋势上看，两者存在一定的联系。随后，通过亮氨酸注射和添食，我们发现亮氨酸能够激活丝腺mTORC1信号，促进丝素蛋白(BmFibH、BmFibL、BmP25)及转录因子Bmdimm表达。因此，我们推测BmSLC7A5可能参与丝腺亮氨酸含量的调节，进而影响mTORC1信号和丝蛋白的翻译合成。
随后，利用CRISPR/Cas9技术，我们获得了全身性敲除BmSLC7A5基因的突变品系。结果发现，敲除该基因后，突变体家蚕的生长发育受阻，个体变小，幼虫生长周期延长。其丝腺mTORC1信号显著的减弱，丝素蛋白及其转录因子Bmdimm的表达明显被抑制，且突变体家蚕的丝腺、蚕茧明显变小，吐丝量(茧层重)减少了2.8倍。而纯合体家蚕在胚胎期出现发育延迟，当其发育至2龄起蚕时出现致死表型。此外，我们在家蚕后部丝腺特异敲除BmSLC7A5，结果发现敲除个体的丝腺明显变小，其吐丝量(茧层重)降低31%，茧层率降低了2个百分点。为了获得吐丝量增加的家蚕品系并验证BmSLC7A5的功能，我们在后部丝腺过量表达了BmSLC7A5基因。分子检测结果显示，转基因家蚕丝腺的mTORC1信号显著的增强，丝素蛋白(BmFibH、BmFibL、BmP25)及转录因子(Bmdimm、BmSage)的表达明显增加。经济性状统计结果显示，转基因家蚕的丝腺、蚕茧明显变大，吐丝量(茧层重)显著的增加25%，茧层率也提高了2个百分点。
综上所述，本文从蛋白质翻译水平，证明了丝蛋白合成所需的主要氨基酸以及mTORC1信号通路能够参与调节丝蛋白合成的效率。此外，从营养信号的角度初步解析了5龄期家蚕丝蛋白大量合成的分子机制，为增加蚕丝产量提供了新的方向和思路。
提高茧层率的实质就是增加丝蛋白的相对合成量，可以从两个方面进行思考：延长丝蛋白合成的时间、增强丝蛋白合成的效率。延长丝蛋白合成的时间，实际是通过延长幼虫生长周期来达到目的，这将会增加桑叶的消耗和人力的投入，从产业的角度来看，实际的收益并未明显增加。所以我们将关注点放到了提高丝蛋白合成效率上。首先，蛋白质的翻译需要以氨基酸作为原料，当氨基酸原料增多时，能够一定程度的增加蛋白质的合成量。因此，增加丝蛋白合成的氨基酸原料是提高丝蛋白合成效率的潜在手段。经过前期的分析，我们发现丝蛋白合成所需要的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸)是重要的突破口，三种氨基酸占丝素蛋白组分的85%以上。值得注意的是，甘氨酸占丝素蛋白组分的45.9%，是丝蛋白合成的主要氨基酸原料，同时甘氨酸可以通过转氨和脱氨作用转变为丝氨酸和丙氨酸。利用氨基酸转运体将血淋巴中的甘氨酸转运到丝腺细胞内，从而增加丝蛋白合成的氨基酸原料，最终可能达到增加丝蛋白合成量且获得高茧层率家蚕品系的目的。其次，在蛋白质翻译过程中，mTORC1信号通路发挥了重要的调节功能，它响应机体的氨基酸营养信号，调节蛋白质的翻译合成。一头蚕一生食下20g的桑叶，合成0.5g的蚕丝蛋白，其丝腺内部蛋白质的合成十分旺盛，所以丝腺也被视为一个蛋白质生产工厂。从5龄期开始，家蚕幼虫的食桑量急剧增加，血淋巴中营养物质(尤其是氨基酸)明显增多，丝蛋白大量合成且丝腺迅速增大。我们推测，这个时期氨基酸营养信号可能通过mTORC1信号通路参与丝蛋白的合成调控，因此我们想进一步探究氨基酸营养信号、mTORC1信号通路、家蚕丝蛋白三者之间的关系，并期许利用氨基酸转运体调节丝腺内的mTORC1信号，增强丝腺细胞的蛋白翻译效率，提高家蚕丝蛋白的合成能力。
鉴于此，本研究采用生物信息学和分子生物学中的多种技术手段，在蛋白质翻译过程，研究丝蛋白合成所需要主要氨基酸(甘氨酸)和mTORC1信号通路对丝蛋白合成效率的影响。利用遗传操作改变丝腺中氨基酸(甘氨酸)的水平以及调节mTORC1信号的激活，增加了丝蛋白合成的效率，获得了三个吐丝量和茧层率显著提高的转基因家蚕品系。此外，利用转基因技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术，证明BmSLC7A5通过调节5龄期丝腺中的亮氨酸含量，调控mTORC1信号的激活，从而控制丝蛋白及相关转录因子的合成。本研究结果如下：
1.家蚕SLC6/7基因家族成员的鉴定及进化关系、表达特征分析
基于丝蛋白合成所需要的主要氨基酸(甘氨酸)和mTORC1信号通路，我们分别筛选出了参与甘氨酸转运和mTORC1信号通路激活的两个溶质载体基因家族，即溶质载体基因家族6/7。首先，我们对家蚕SLC6家族进行了全基因组的鉴定，并对这些基因的保守性、进化关系、表达模式、潜在生理功能进行了初步的分析，结果发现在家蚕基因组中总共有16个SLC6家族成员。昆虫的SLC6家族主要分为五个亚家族：NATs、AATs、INE、NTTs、Orphan，而家蚕SLC6家族成员在五个亚家族均有分布。组织表达谱显示，BmNAT1、BmNAT2、BmGT1-L、BmSLC6-15、BmINE、BmGT1基因主要在家蚕的中肠表达。时期表达谱显示，中肠高量表达的基因在5龄盛食期持续表达可能参与营养氨基酸的吸收，而脑部高量表达的BmGAT1、BmGT2、BmDAT、BmSERT、BmB(0)AT3-1、BmB(0)AT3-2基因可能参与家蚕的上蔟和交配行为。
其次，通过同源序列比对，我们在家蚕基因组中总共鉴定到了12个SLC7家族成员。对所有成员的序列相似性和进化关系进行分析，发现与其他物种相似，家蚕SLC7家族的成员主要被划分为两个亚家族，分别为CATs和HATs。此外，在表达模式上SLC7家族成员具有广泛的组织分布，多个基因在马氏管中高量表达。而BmSLC7A5基因在家蚕的丝腺中高量表达，我们推测由于表达位置的差异，BmSLC7A5基因应该有着不同于该家族其他成员的生理功能。
2.家蚕BmGT1-L基因的功能研究及利用
由于本部分研究主要关注丝蛋白合成所需的氨基酸原料(甘氨酸)，所以将上一章筛选出的甘氨酸转运蛋白作为研究靶标。在家蚕SLC6家族中，有三个甘氨酸转运蛋白，其中BmGT1-L在中肠特异且高量表达，可能在甘氨酸的吸收利用过程中发挥重要作用，因此我们选择BmGT1-L基因进行后续研究。利用RT-PCR、Q-PCR、Westernblotting等方法，在转录水平和蛋白水平对BmGT1-L进行表达特征的检测，并对其进行组织免疫荧光定位分析。结果发现，BmGT1-L在转录和蛋白水平都在家蚕中肠特异表达。免疫荧光定位显示，BmGT1-L蛋白表达于中肠上皮细胞特化形成的微绒毛上，推测其可能参与微绒毛对营养物质的吸收。BmGT1-L基因表达水平在起蚕期明显高于眠期，推测该基因可能受到食物或保幼激素的诱导。为了进一步验证上述推测，对家蚕个体和离体中肠分别进行了饥饿处理和JHA诱导。结果显示，BmGT1-L基因的表达会受到食物和保幼激素的诱导。此外，通过抑制剂处理，间接证明了BmGT1-L蛋白具有甘氨酸转运能力。这些结果表明，家蚕中肠高量表达的BmGT1-L可能参与肠道内甘氨酸的吸收转运。综上所述，BmGT1-L具有的甘氨酸转运能力，能作为增加丝腺内部甘氨酸水平的分子靶标。
为了验证增加丝蛋白合成所需的氨基酸原料是否能提高丝蛋白的合成量，我们以BmGT1-L为靶标，利用后部丝腺特异表达的BmFibH基因的启动子和BmGT1-L基因CDS序列，构建piggyBac[3×P3-Red，BmFibhP-BmGT1-L]转基因重组载体，并获得了后部丝腺异位表达BmGT1-L基因的转基因家蚕。结果显示，转基因家蚕丝蛋白合成量显著提高，其吐丝量(茧层重)增加了11%、茧层率提高了1个百分点，其经济性状得到了较明显的提高。分子检测表明，后部丝腺中BmGT1-L的异位表达促进了甘氨酸的生物合成，并通过增加丝素蛋白的合成提高家蚕的吐丝量。本部分研究结果将促进对BmGT1-L功能的认识，并从增加丝蛋白合成所需氨基酸的角度为提高蚕丝产量提供新的思路。
3.mTORC1信号通路调节家蚕丝蛋白合成
本部分研究，将焦点集中于丝蛋白合成的翻译调控上，我们分析了蛋白质翻译过程中的诸多影响因素。结果发现，在蛋白质翻译过程中，mTORC1信号通路够响应氨基酸营养信号，调控蛋白质的合成。因此，mTORC1信号通路与家蚕丝蛋白合成是否有关就值得深入探究。首先，利用rapamycin抑制剂，我们在体内和体外分别处理了丝腺。结果发现，处理组mTORC1信号通路靶蛋白4EBP和S6K磷酸化水平明显降低，同时丝蛋白基因(BmFibH、BmFibL、BmP25)及相关转录因子(Bmdimm、BmSGF1)的表达被显著的抑制，丝蛋白的合成量也明显减少。与对照相比，抑制剂处理组丝腺的体积减小，茧的尺寸变小，吐丝量(茧层重)降低45%，茧层率降低7.3个百分点，但是蛹的重量增加了21%。其次，为了正向验证mTORC1信号通路对丝蛋白合成的调控，我们利用转基因技术在家蚕后部丝腺过量表达了能够直接激活mTORC1的BmRheb基因。BmRheb增量表达后，丝腺内4EBP和S6K磷酸化水平明显增加，同时丝蛋白(BmFibH、BmFibL、BmP25)及相关转录因子(Bmdimm、BmSage)的表达上调，丝蛋白的合成量也明显增加。此外，蚕茧和丝腺的大小显著的变大，其吐丝量(茧层重)增加了16%、茧层率提高了1.5个百分点。总的来说，mTORC1信号通路能够明显的影响丝蛋白的合成。
4.BmSLC7A5介导亮氨酸-mTORC1信号调节丝蛋白合成
为了进一步解析mTORC1信号通路在丝腺中调节丝蛋白合成的分子机制，我们进行了深入的分析。在其他物种中，SLC7A5被报道参与mTORC1信号通路的激活，而我们前期的研究发现，BmSLC7A5基因在丝腺中高量表达，这暗示着该基因可能通过mTORC1信号通路调节丝蛋白合成。所以，我们选取家蚕丝腺高量表达的BmSLC7A5基因开展了后续的研究。首先，对BmSLC7A5进行了组织表达特征检测以及免疫荧光定位分析。结果显示，该基因在丝腺、中肠、脂肪体高量表达，其中丝腺内的相对表达量最高，且主要定位于丝腺细胞质和细胞膜。在整个5龄期，BmSLC7A5在5龄前3天表达较高，随后开始下降，而后部丝腺中的亮氨酸含量也是在5龄前3天较高，随后减少。从变化趋势上看，两者存在一定的联系。随后，通过亮氨酸注射和添食，我们发现亮氨酸能够激活丝腺mTORC1信号，促进丝素蛋白(BmFibH、BmFibL、BmP25)及转录因子Bmdimm表达。因此，我们推测BmSLC7A5可能参与丝腺亮氨酸含量的调节，进而影响mTORC1信号和丝蛋白的翻译合成。
随后，利用CRISPR/Cas9技术，我们获得了全身性敲除BmSLC7A5基因的突变品系。结果发现，敲除该基因后，突变体家蚕的生长发育受阻，个体变小，幼虫生长周期延长。其丝腺mTORC1信号显著的减弱，丝素蛋白及其转录因子Bmdimm的表达明显被抑制，且突变体家蚕的丝腺、蚕茧明显变小，吐丝量(茧层重)减少了2.8倍。而纯合体家蚕在胚胎期出现发育延迟，当其发育至2龄起蚕时出现致死表型。此外，我们在家蚕后部丝腺特异敲除BmSLC7A5，结果发现敲除个体的丝腺明显变小，其吐丝量(茧层重)降低31%，茧层率降低了2个百分点。为了获得吐丝量增加的家蚕品系并验证BmSLC7A5的功能，我们在后部丝腺过量表达了BmSLC7A5基因。分子检测结果显示，转基因家蚕丝腺的mTORC1信号显著的增强，丝素蛋白(BmFibH、BmFibL、BmP25)及转录因子(Bmdimm、BmSage)的表达明显增加。经济性状统计结果显示，转基因家蚕的丝腺、蚕茧明显变大，吐丝量(茧层重)显著的增加25%，茧层率也提高了2个百分点。
综上所述，本文从蛋白质翻译水平，证明了丝蛋白合成所需的主要氨基酸以及mTORC1信号通路能够参与调节丝蛋白合成的效率。此外，从营养信号的角度初步解析了5龄期家蚕丝蛋白大量合成的分子机制，为增加蚕丝产量提供了新的方向和思路。