牛支原体表面一种新的膜蛋白(P41)的鉴定及特性研究

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牛支原体(Mycoplasma bovis, M.bovis)可以引起犊牛肺炎、脓性关节炎、中耳炎和乳房炎,也有报道可以引起角膜炎,结膜炎和脑炎。2008年5月,我国湖北省首次发现由M.bovis引起的传染病,共计造成2582头牛发病,死亡610头。本实验室于2008年就在湖北分离到M.bovis分离株Hubei-1株。病原体对宿主的黏附是支原体感染的第一步,是支原体致病机理研究的一个重要方面。虽然目前部分支原体的黏附蛋白已经被鉴定,但主要集中在能引起人类传染病的生殖支原体和肺炎支原体,引起动物传染病的无乳支原体和猪附红细胞体中。而国际上有关M.bovis黏附蛋白的相关报道较为少见。对M.bovis的黏附过程进行深入研究不仅对M.bovis感染的预防以及控制极为重要,而且可以为M.bovis的致病机理及其引起的宿主免疫反应提供重要理论依据。我们在M.bovisHubei-1株全基因组测序的基础上,根据生物信息学,选取了一个891bp的P41基因,重点研究其可能具有的黏附特性及其发挥黏附作用的区域。M.bovis Hubei-1株P41基因和P41b基因分别编码一个32ku的蛋白P41及一个17ku的蛋白P41b。其中P41b蛋白为P41蛋白的C端。我们利用原核表达系统得到了P41和P41b的重组蛋白(rP41和rP41b),并利用该重组蛋白制备了高免兔血清。提取M.bovis的膜蛋白和胞浆蛋白进行western blot分析,结果显示P41是M.bovb的一种膜蛋白。将M.bovis以及纯化后的rP41和rP41b与多聚甲醛固定的胎牛肺细胞(embryonic bovine lung,EBL)细胞分别作用,荧光免疫染色后,利用激光共聚焦显微镜观察到rP41,rP41b和M.bovb均对EBL细胞具有明显的黏附现象,并且rP41和rP41b的黏附作用可以被兔抗各自抗体所抑制,同时,兔抗rP41抗体,兔抗rP41b抗体以及M.bovis抗体对M.bovis的黏附过程也均可起到阻断作用。随后,夹心ELISA实验中,以定量的方式研究了rP41,rP41b和M.bovis对EBL细胞各组分的黏附趋势。黏附实验结果显示,rP41,rP41b和M.bovis可以广泛的黏附于EBL细胞各组分蛋白,并且蛋白黏附总量与蛋白浓度呈正相关。黏附抑制试验结果显示,这种黏附作用可被不同稀释度的抗体不同程度的抑制。并且抑制程度也与抗体浓度成正比。本实验最终证实,P41蛋白是M.bovis的黏附相关蛋白,对EBL细胞具有明显的黏附作用。P41蛋白的C端发挥着黏附作用。
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