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作为面筋蛋白主要成分的高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)是影响小麦面粉加工品质的重要因素。小麦胚乳中,HMW-GS与低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)主要以二硫键相互交联形成谷蛋白大聚体,构成面筋蛋白的网状骨架。一般认为,HMW-GS的分子长度和二硫键的数量与分布是影响面筋质量的重要因素,但一直缺乏直接的实验证据。本研究以HMW-GS1Dx2及1Dx5为模板,通过改造其中部重复区的长度和半胱氨酸残基的数目及分布,结合转基因方法研究突变HMW-GS对加工品质特性的影响,以期阐明小麦加工品质性状形成的分子机制,为小麦品质性状的分子改良提供理论依据和新的基因资源。 本文以1Dx2及1Dx5基因为模板,通过定点诱变的方法创制了8个编码半胱氨酸残基(Cysteine,Cys)数目及分布变异的HMW-GS基因突变体,其中添加Cys的7个,分别为1Dx2m1、1Dx2m2、1Dx2m3、1Dx2m1/2、1Dx2m1/3、1Dx2m2/3和1Dx2m1/2/3,去除Cys的1个,为1Dx5m;通过PCR结合限制性内切酶酶切连接的方法创制了9个中部重复区长度变异的HMW-GS基因突变体,包括中部重复区缩短的3个,即1Dx2Rp113、1Dx2Rp311和1Dx2Rp471,延长的5个,分别为1Dx2Rp876、1Dx2Rp951、1Dx2Rp1056、1Dx2Rp1174和1Dx2Rp1353,完整编码区序列重复的1个,为1Dx2dp。 构建了全部17个突变基因及2个对照基因(1Dx2和1Dx5)的植物表达载体,采用基因枪轰击法转化普通小麦品种科农199的1Dx2亚基缺失突变体KN2-,19个转化载体共获得528个T0代阳性转基因植株。利用SDS-PAGE方法对T2代转基因株系中目的基因的表达情况进行了检测,在所检测的376个T2代转基因株系中,214个株系有外源蛋白的表达。但未获得表达1Dx2Rp1174的转基因株系。 利用RP-HPLC和光密度分析的方法对T4代转基因株系种子的麦谷蛋白亚基各组分含量进行了分析。结果表明,大多数转基因株系的各个内源HMW-GS亚基的表达量与对照品种没有显著差异,外源亚基的表达量差异相对较大。利用近红外光谱分析仪对各转基因株系的面粉特性进行分析。转基因系的面粉蛋白含量都在10.49-13.07%之间。 测定了Cys变异转基因系面粉的谷蛋白聚合体含量(UPP,EPP,UPP%等)、SDS-沉降值(SDS-SV)、谷蛋白溶胀指数(SIG)以及面团的揉混仪及粉质仪参数。结果表明,TL1Dx2m1/2在各项测定指标中均拥有最优异的检测值,其形成时间和稳定时间分别为15.87min和10.93min,均达到对照品种KN199的4倍以上。其次为TL1Dx2m1/2/3、TL1Dx2m2、TL1Dx2m1和TL1Dx5,它们也具有较好的品质参数,形成时间和稳定时间也都在5min以上。TL1Dx2m3的品质也优于TL1Dx2,而TL1Dx2m1/3、TL1Dx2m2/3和TL1Dx5m各品质参数与TL1Dx2无显著差别。在3个Cys突变位点中,m2位点拥有最好的品质效应,其次为m1位点,m3位点的品质效应相对较弱。在突变位点组合中,m1和m2位点组合具有最好的品质效应。同时,实验结果还显示,模仿1Dx5的突变基因1Dx2m1也有较强的正向品质效应,突变亚基1Dx2m1作用接近于优质亚基1Dx5,而去除1Dx5中部重复区Cys则表现出明显的负向品质效应。实验证明HMW-GS中部重复区的半胱氨酸残基对小麦加工品质有明显的正向影响,并且这种正向影响存在明显的位置效应和累加效应。1Dx5亚基中部重复区的Cys对其优质特性起到了决定性的作用。 测定了1Dx2亚基分子长度变异转基因系面粉的UPP%、SDS-SV、SIG、揉混仪和粉质仪参数。结果发现,分子长度最短的突变基因转基因系TL1Dx2Rp113具有最好的品质参数,其形成时间和稳定时间分别为12.70min和17.17min,显著优于KN199。TL1Dx2Rp311与TL1Dx2相比也具有稍好的品质特性,而TL1Dx2Rp471的面团品质特性较差。在延长的突变基因转基因系中,TL1Dx2Rp1353的品质参数优于TL1Dx2,其它转基因系绝大部分的品质参数都显著低于TL1Dx2。实验结果说明,中部重复区长度对加工品质有正向效应,在一定分子长度范围内,中间重复区长度与品质参数存在正相关关系。