论文部分内容阅读
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，PHA)被认为是可以替代石化塑料的绿色塑料。目前，PHA大规模产业化生产都是以细菌为生产菌，采用生物发酵技术进行。但是，由于生产成本较高，PHA普及程度和应用范围都受到了很大的限制。极端嗜盐古菌做为PHA生产菌，由于其对高盐环境依赖和独特的代谢途径，有望降低PHA的生产成本，推进其普及。本论文以地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)为生产菌，在其发酵工艺的优化和遗传工程菌的构建两个方面进行探索。 首先是发酵工艺的优化。通过优化缓冲剂的浓度和发酵时间，建立了摇瓶水平优化发酵培养基组分的系统。使用二水平分式析因设计和单因素多水平设计，优化了发酵培养基的组分。并对不同的单克隆菌株进行评价，筛选了一株PHA积累量相对较高的菌株，进行发酵罐水平发酵工艺的优化。在优化发酵工艺之前，为了检测发酵液中关键组分在发酵过程中的浓度变化，建立了不同组分的检测方法，包括淀粉、总糖、氯化铵、磷酸二氢钾等。发酵罐水平，首先获得了批次发酵的基本数据，并基于在PHA积累阶段碳氮源的消耗情况，初步确立了补料培养基。接着对不同的补料方式进行评价，PHA浓度方面，pH-stat联控补料比批量补料要高;通过分析pH-stat联控补料的补料曲线，发现其呈良好的线性，然后通过恒速补料对其模拟，得到稳定的发酵结果。最后，总结了种子培养基组分和接种量的优化。 在发酵工艺优化过程中，发现随着菌体浓度的提高，发酵液会变得很黏，不仅发酵液容易起泡，而且溶氧降低。发酵液变黏认为是地中海富盐菌分泌胞外多糖到发酵液中并累积所致，故我们计划切断其胞外多糖合成途径。 通过对地中海富盐菌基因组序列的分析，预测了胞外多糖合成相关的基因簇。通过分子遗传学的方法，敲除基因簇中的关键基因HFX_2145-2148，菌落形态发生很大的变化，胞外多糖的浓度也极大地下降;采用高灵敏度的离子色谱法检测胞外多糖中的甘露糖基组分，相应的信号峰也不存在。进一步的回补实验证实基因HFX_2145-2148的回补可以使菌株恢复原来的性状。以上结果说明基因HFX_2145-2148敲除株失去了合成胞外多糖的能力，HFX_2145-2148是胞外多糖合成的关键基因。 在摇瓶水平检测HFX_2145-2148敲除株积累PHA的情况，发现PHA的浓度较对照菌株要高。于是，基于HFX_2145-2148的敲除株(pyrF-，尿嘧啶合成缺陷)，构建了可用于发酵罐水平发酵的工程菌H mediterranei ES1(pyrF+，可以合成尿嘧啶），比较其与野生型的差异。菌株ES1的发酵液黏度降低，起泡量减少，溶氧升高;虽然菌株ES1消耗糖分的速率降低，但其生长没有受到显著影响，相反，其具有更高的PHA积累能力。发酵结束，菌株ES1积累的PHA浓度比野生型提高了20％。 综上所述，我们优化了极端嗜盐古菌发酵生产PHA的培养基组分和发酵工艺，并通过分子遗传学方法得到了一株PHA高产菌株，同时解决了发酵过程中发酵液变黏的问题。以上在发酵工艺优化和生产菌株改造方面的工作，都积极地推动了极端嗜盐古菌生产PHA的产业化进程。