【摘 要】
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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起,临床上表现严重的间质性肺炎,提示炎症因子在PRRSV的致病中扮演着十分重要的角色,但其作用的分子细节尚不十
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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起,临床上表现严重的间质性肺炎,提示炎症因子在PRRSV的致病中扮演着十分重要的角色,但其作用的分子细节尚不十分清楚。趋化因子RANTES是一种重要的炎症因子,能高效趋化T淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞,调节白细胞移行到感染部位,从而参与激活免疫反应。但RANTES与PRRSV感染之间的关系尚不清楚,鉴于此,本课题开展了PRRSV感染细胞后RANTES的表达以及PRRSV调控RANTES表达信号通路的研究。具体内容如下：1.PRRSV感染Marc-145细胞激活RANTES利用荧光定量RT-PCR和RANTES启动子荧光素酶报告系统,于感染后不同时间检测RANTES的表达,发现PRRSV感染Marc-145细胞显著上调RANTES基因的转录,且呈感染时间和感染剂量依赖性。进一步的研究发现,紫外灭活的PRRSV不能激活RANTES,提示PRRSV激活RANTES与PRRSV的增殖密切相关。2.PRRSV感染Marc-145细胞激活RANTES与NF-κB密切相关利用RANTES启动子各转录因子结合位点缺失突变体的荧光素酶报告系统,发现核因子κB (NF-κB)在PRRSV感染激活RANTES中起最关键的调节作用,干扰素刺激反应元件ISRE不参与RANTES基因的转录,而CRE和NF-IL6位点对PRRSV激活RANTES的作用不显著。为了证实转录因子NF-κB在PRRSV感染激活RANTES中的关键作用,进一步利用NF-κB抑制剂BAY11-7082处理细胞或以IkB的负调控突变体(mIκBα)表达质粒转染细胞,结果均能显著抑制PRRSV诱导的RANTES基因转录,说明NF-κB信号通路确实参与PRRSV诱导RANTES.3.PRRSV感染Marc-145细胞激活RANTES的上游信号通路分析为了揭示PRRSV感染激活RANTES产生的上游信号通路,以MAPK通路的反式激活质粒pFA2-ELK1转染细胞,证实PRRSV感染Marc-145细胞能激活MAPK通路。进一步采用ERK1/2、p38和JNK这3条MAPK通路的抑制剂分别处理细胞,结果发现ERK1/2抑制剂U0126呈浓度依赖性下调RANTES基因的转录,转染ERK负调控突变体也得到了相同的结果,表明ERK1/2通路参与了PRRSV诱导RANTES的产生。同时,对NF-κB的两条上游信号通路TLRs、RIG-Ⅰ的主要接头蛋白(MyD88、TRIF、TRAF6、RIG-Ⅰ、TRAF2)在PRRSV感染激活RANTES中的作用进行分析,发现TLR信号通路中接头分子MyD88、TRIF、TRAF6参与了PRRSV感染激活RANTES,而与RIG-Ⅰ和TRAF2无关,说明PRRSV感染主要通过TLR通路诱导RANTES的产生,但RIG-Ⅰ通路的作用不大。
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