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目的: 帕金森病（Parkinson’ disease, PD）是仅次于阿尔兹海默病（Alzheimer disease, AD）的第二大神经系统退行性疾病，随着年龄的增长，帕金森病的患病率不断增高。帕金森病以静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势平衡障碍等运动症状为主要临床特征。除此之外，还会表现出一些非运动症状，包括：嗅觉减退、自主神经功能障碍、认知减退、睡眠障碍、以及精神心理障碍等。帕金森病的主要病理特征为黑质多巴胺能神经元进行性变性丢失，残余的少量神经元细胞浆内出现Lewy小体（Lewy body）。帕金森病的病因及发病机制尚不完全明确，目前认为帕金森病并非单因素所致，而是在多因素交互作用下发病，年龄、环境及遗传因素等共同影响着帕金森病的发生发展。氧化应激反应、线粒体功能缺陷、蛋白清除降解功能异常、炎症反应等机制参与于帕金森病的进程中。 当疾病发生时，受损的细胞可释放大量的三磷酸腺苷（ATP），ATP除作为细胞的直接供能物质之外，还可以充当信号分子起到细胞内外信号传递的作用。ATP可与胞膜上的嘌呤受体（P受体）特异性结合，激活下游的信号因子及信号通路，调节细胞的生理活动。ATP的受体主要分为P1受体（G蛋白耦联受体）和P2受体（P2X离子通道和P2Y G蛋白耦联受体）。P2X受体有7种亚型：P2X1~P2X7，选择性地转运钠离子、钾离子和钙离子。P2X4受体中枢神经系统中表达量最高的P2X亚型，在小胶质细胞上有大量分布。小胶质细胞作为神经系统的巨噬细胞，参与神经炎症过程，而小胶质细胞上的P2X4受体也在炎症反应中发挥重要作用。 Mek-Erk1/2信号通路是丝裂原活化蛋白激酶（ mitogen-activated protein kinase ， MAPK）信号转导通路之一，参与细胞的多种重要功能的调控。在神经系统中，它参与神经细胞的分化、存活、可塑性等生理过程，在帕金森病、路易体痴呆、癫痫、阿尔兹海默病、缺血性卒中等多种神经系统疾病中发挥重要作用。 因此，本课题研究目的： 1.检测6-OHDA诱导的帕金森病大鼠模型黑质中P2X4受体及Mek-Erk1/2通路各蛋白的表达，以探讨P2X4受体及Mek-Erk1/2通路在帕金森病发病机制中的作用。 2. 探讨在6-OHDA诱导帕金森病大鼠模型中，ATP-P2X4受体信号轴对Mek-Erk1/2信号通路表达的影响，以探讨调控ATP-P2X4受体信号轴对Mek-Erk1/2信号通路的影响对帕金森病的治疗是否有帮助。 方法： 1.选取SPF级雄性Wistar大鼠40只于标准动物房中适应实验室环境1周后，随机分为两组：空白对照组和6-OHDA组，每组20只。使用水合氯醛将大鼠麻醉，在大鼠脑立体定位仪下定位大鼠左侧黑质，空白对照组和6-OHDA组大鼠黑质分别注入等量含0.2%抗坏血酸的生理盐水和6-OHDA溶液。置于相同环境下饲养1周后，将阿扑吗啡注射入大鼠腹腔诱发大鼠的旋转行为，来筛选成功的帕金森病大鼠模型。将存活及造模成功的大鼠处死后提取整个脑组织，切片后应用免疫荧光染色法检测两组大鼠黑质内酪氨酸羟化酶（Tyrosinehydroxylase，TH）阳性的多巴胺神经元数目的变化情况。分离大鼠脑黑质部分，提取RNA采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测两组大鼠黑质内P2X4受体mRNA的表达情况。分离大鼠脑黑质部分，提取总蛋白应用蛋白印迹（western blot）法检测两组大鼠黑质内P2X4受体、p-Mek1/2、p-Erk1/2蛋白的表达情况。 2. 将SPF级雄性Wistar大鼠随机分为8组（n=20）：空白对照组、6-OHDA组、空载病毒阴性对照组、基因过表达阴性对照组、基因敲减阴性对照组、空载病毒+6-OHDA组、基因过表达+6-OHDA组、基因敲减+6-OHDA组。使用水合氯醛将大鼠麻醉，经大鼠脑立体定位仪定位后，将携带空载siRNA的慢病毒、携带促进P2X4受体表达的siRNA-P2X4+慢病毒、携带抑制P2X4受体表达的siRNA-P2X4-慢病毒分别注入空载病毒阴性对照组和空载病毒+6-OHDA组、基因过表达阴性对照组和基因过表达+6-OHDA组、基因敲减阴性对照组和基因敲减+6-OHDA组大鼠左侧黑质中。慢病毒注射后于标准动物房中适应实验室环境1周，后行6-OHDA造模：于6-OHDA组、空载病毒+6-OHDA组、基因过表达+6-OHDA组、基因敲减+6-OHDA组大鼠黑质中注入6-OHDA溶液；于空白对照组、空载病毒阴性对照组、基因过表达阴性对照组、基因敲减阴性对照组大鼠黑质中注入等量含0.2%抗坏血酸的生理盐水。置于相同环境下饲养1周后，将阿扑吗啡注射入大鼠腹腔诱发大鼠的旋转行为，来筛选成功的帕金森病大鼠模型。将存活及造模成功的大鼠处死后提取整个脑组织，切片后应用免疫荧光染色法检测各组大鼠黑质内酪氨酸羟化酶阳性的多巴胺神经元数目的变化情况。分离大鼠脑黑质部分，提取RNA采用实时荧光定量PCR法检测各组大鼠黑质内P2X4受体mRNA的表达情况。分离大鼠脑黑质部分，提取总蛋白应用蛋白印迹法检测各组大鼠黑质内P2X4受体、p-Mek1/2、p-Erk1/2蛋白的表达情况。 结果： 1. 黑质多巴胺能神经元酪氨酸羟化酶免疫荧光染色结果显示，与空白对照组（7439±111.2，n=16）相比，6-OHDA组（5303±106.3，n=16）黑质中TH阳性多巴胺能神经元数量明显减少，两者的差异具有统计学意义（P<0.01）。RT-qPCR法检测黑质P2X4受体mRNA的表达结果显示，与空白对照组（0.9606±0.0526）相比，6-OHDA组（2.4010±0.1866）黑质中P2X4受体mRNA的表达量明显增高，且差异具有统计学意义（P<0.01）。Western blot法检测黑质P2X4受体蛋白结果显示，与空白对照组（0.7318±0.0196）相比，6-OHDA组（1.2950±0.0253）大鼠黑质中P2X4受体蛋白表达水平明显增加，且两者差异具有统计学意义（P<0.01）。Western blot法检测黑质p-Mek1/2 蛋白结果显示，与空白对照组（ 0.8256±0.0171 ）相比较， 6-OHDA 组（1.3470±0.0206）大鼠黑质中p-Mek1/2蛋白的表达量增加，且两者差异具有统计学意义（ P<0.01 ）。Western blot 法检测黑质 p-Erk1/2 蛋白结果显示，与空白对照组（0.7984±0.0190）相比，6-OHDA组（1.3220±0.0345）大鼠黑质内p-Erk1/2蛋白的表达量增加，且差异具有统计学意义（P<0.01）。 2. 黑质多巴胺能神经元酪氨酸羟化酶免疫荧光染色结果显示：与空载病毒+6-OHDA组（5188±149.70，n=15）相比，基因过表达+6-OHDA组（4478±118.10，n=15）黑质TH阳性多巴胺能神经元数目明显减少，基因敲减+6-OHDA组（5929±123.70，n=15）黑质TH阳性多巴胺能神经元数目明显增加，具有统计学意义（P<0.01）。RT-qPCR结果显示：与空载病毒+6-OHDA组（2.3220 ±0.1115）相比，基因过表达+6-OHDA组（3.4010±0.1581）大鼠黑质内P2X4受体mRNA的表达明显增加（ P<0.01 ）。与空载病毒+6-OHDA组对比，基因敲减+6-OHDA组（1.2870±0.0359）大鼠黑质内P2X4受体mRNA的表达明显减少（P<0.01）。Western blot法检测P2X4受体蛋白在大鼠脑黑质内的表达情况结果显示：与空载病毒+6-OHDA组（1.1670±0.0439）对比，基因过表达+6-OHDA组（1.5210±0.0707）大鼠黑质内P2X4受体的表达增加，差异有统计学意义（P<0.01）。与空载病毒+6-OHDA组（1.3060± 0.0364）相比较，基因敲减+6-OHDA组（0.9574±0.0160）大鼠黑质内P2X4受体的表达减少，差异有统计学意义（ P<0.01 ）。Western blot法检测上调P2X4受体表达后p-Mek1/2蛋白在大鼠脑黑质内的表达情况，结果显示：对于空载病毒+6-OHDA组（1.1400±0.0574），基因过表达+6-OHDA组（1.5470±0.0315）大鼠黑质p-Mek1/2蛋白的表达增加，差异有统计学意义（P<0.01）。Western blot法检测下调P2X4受体表达后 p-Mek1/2 蛋白在大鼠脑黑质内的表达情况：对于空载病毒+6-OHDA 组（1.185±0.0428），基因敲减+6-OHDA组（0.9975±0.0315）大鼠黑质p-Mek1/2蛋白的表达减少，差异有统计学意义（P<0.01）。Western blot法检测上调P2X4受体表达后p-Erk1/2蛋白在大鼠脑黑质内的表达情况，结果显示：对于空载病毒+6-OHDA组（1.3010±0.0447），基因过表达+6-OHDA组（1.7690±0.0423）大鼠黑质p-Erk1/2蛋白的表达增加，差异有统计学意义（P<0.01）。Western blot法检测下调P2X4受体表达后 p-Erk1/2 蛋白在大鼠脑黑质内的表达情况：对于空载病毒+6-OHDA 组（1.350±0.0258），基因敲减+6-OHDA组（0.9174±0.0411）大鼠黑质p-Erk1/2蛋白的表达减少，差异有统计学意义（P<0.01）。 结论: 1. 在6-OHDA诱导的帕金森病动物模型脑组织中，P2X4受体的表达明显增加， Mek-Erk1/2信号通路的激活增加，黑质多巴胺能神经元减少，表明P2X4受体及Mek-Erk1/2通路参与帕金森病发病机制。 2. 在6-OHDA诱导的帕金森病动物模型中， ATP-P2X4受体信号轴上调会增加Mek-Erk1/2信号通路的活化，使黑质多巴胺能神经元丢失增多；下调时可减少Mek-Erk1/2信号通路的活化，减轻黑质多巴胺能神经元丢失。帕金森病的发生可能与ATP-P2X4受体信号轴活化，激活下游Mek-Erk1/2信号通路，造成黑质多巴胺能神经元丢失有关。控制ATP-P2X4受体信号轴对Mek-Erk1/2信号通路的影响可能对帕金森病的治疗有一定的帮助。