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昆虫是动物界种类和数量最多的生物类群之一，由35个目组成。鳞翅目是昆虫第二大目，不仅包括家蚕（Bombyx mori）这一重要的经济性昆虫，也包括棉铃虫（Helicoverpa armigera），斜纹夜蛾（Spodoptera litura），小菜蛾(Plutellaxylostella)和松毛虫（Dendrolimus punctatus）等农林业害虫。针对这些害虫，传统的以化学农药为主的防治措施在杀灭害虫的同时对环境和其他生物造成了严重的危害。近几年，家蚕遗传操作体系逐渐完善，这不仅拉开了鳞翅目昆虫功能基因研究的新篇章，也为遗传调控技术在鳞翅目害虫防治方面提供了新策略。 RNA interference(RNAi)是进化上保守的生物体防御外界病毒入侵的生理过程。狭义的RNAi只包括small interference RNA(siRNA)介导的转录后调控，广义的RNAi还包括microRNA(miRNA)以及PIWI-interacting RNA(piRNA)介导的基因调控。由于鳞翅目害虫对于RNAi很不敏感，特别是在摄食旺盛，对农作物危害大的幼虫期，很少有RNAi成功的案例。这严重阻碍了RNAi技术在鳞翅目害虫基因功能研究和遗传防治方面的推广。因此，对于家蚕RNAi关键基因的功能和基础应用研究，有着非常重要的意义。一方面，可以加深对鳞翅目昆虫RNAi机理的认识，从分子水平理解鳞翅目昆虫RNAi不敏感的原因。另一方面，这些研究成果可以作为理论依据，为基因功能研究和鳞翅目害虫防治提供技术支撑。 基于此，论文研究主要包括以下几个方面的内容: (1)利用double RNAi技术，在家蚕BmN细胞系中对RNAi通路的关键基因进行了筛选，发现家蚕Argonaute2(BmAgo2)基因参与double-stranded RNA(dsRNA)以及short-hairpin RNA(shRNA)促发的RNAi反应，而BmDicer2参与dsRNA引发的RNAi。利用RNA Electrophoretic Mobility Shift Assay(RNA EMSA)实验，在体外证实BmAgo2蛋白可以在BmDicer2，heat-shock protein70(HSP70)等辅助因子的帮助下结合siRNA，实现靶标基因的沉默。这些结果揭示了BmAgo2和BmDicer2是家蚕RNAi反应的限速步骤; (2)利用piggyBac介导的转基因技术，我们在家蚕体内分别过表达BmAgo2和BmDicer2两个基因。在幼虫期，通过体腔注射dsRNA和与表达shRNA的转基因家蚕品系进行杂交，证明了BmAgo2基因的过表达能够增强家蚕幼虫期的RNAi效率。而BmDicer2基因的过表达可以增强幼虫期dsRNA引发的RNAi。同时过表达这两个基因，可以延长体腔注射RNAi效率的增强时间。虽然体腔注射dsRNA的RNAi效率增强比较有限，利用shRNA介导的转基因RNAi的增强效果很明显，这为我们利用RNAi进行功能基因研究和寻找害虫防治靶点提供了借鉴; (3)在家蚕体内建立了双系的转基因CRISPR/Cas9(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/RNA-guided Cas9 nucleases)体系，成功敲除了家蚕PIWI基因。PIWI突变体中出现了雌性家蚕雄性化的特征，包括外生殖器的转变和家蚕胚胎期发育的缺陷。RNA-seq结果表明，PIWI突变可以导致细胞生长，分化和细胞周期相关基因表达的改变。同时我们还发现，一些与性别分化相关的信号通路在PIWI敲除后受到了影响。这项研究利用转基CRISPR/Cas9技术对家蚕Ago蛋白的功能进行了深入的分析; (4)在前期的工作中，我们在家蚕中克隆得到了一个胚胎致死基因PDP1，需要对其进行深入的功能分析。在CRISPR/Cas9技术还不成熟的背景下，我们期望利用赤拟谷盗（Tribolium castaneum）RNAi效果强烈的优势，在赤拟谷盗中对该基因进行功能研究。研究结果表明，幼虫期的RNAi导致虫体在化蛹后立即死亡。通过组织染色，我们发现PDP1基因的下调表达影响了脂肪体的解离，从而抑制虫体的能量代谢。这项工作证明了鞘翅目昆虫对于RNAi反应很敏感，同时，也为生理节律和能量代谢之间的关联提供了有力的证据; (5)利用Gal4/UAS转基因技术，研究了家蚕蜕皮激素失活基因cytochrome18A1(CYP18A1)的功能。该基因介导中部丝腺特异的20E失活途径，无论是全身还是中部丝腺特异地过表达BmCYP8A1都会导致五龄幼虫的死亡。这项工作一方面揭示了家蚕组织特异性的20E失活途径，另一方面为蜕皮激素的失活在家蚕完成生长发育过程中的重要作用提供了直接证据。