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microRNAs(miRNAs)是一类非编码RNA,短单链,长度约22 bp,且在进化过程中高度保守。miRNAs在单细胞和多细胞生物中广泛存在,在转录后水平对基因表达进行调控。现有研究表明miRNA-1和miRNA-133来源于同一对双顺反子(Bicistronic pairs),并对骨骼肌的发生发育有重要的调控作用,而关于鸭miRNA-1和miRNA-133对骨骼肌发育的研究还尚未见有报道。本实验以体型大小不同的樱桃谷鸭和莆田黑鸭(白羽系)作为实验对象,通过实时荧光定量技术构建鸭miRNA-1和miRNA-133的组织表达谱和发育性表达谱;并通过转染miRNA的模拟物或抑制物,采用双荧光素酶报告基因系统对鸭miRNA-1和miRNA-133的功能进行初步探讨,以了解其在鸭骨骼肌发育中的调控作用。主要研究结果如下:1.为探明樱桃谷鸭和莆田黑鸭(白羽系)的肌肉生长发育与肌纤维发育规律,分别对38、42、45、49、56等不同日龄胸肌重、腿肌重、肌纤维面积等表型进行了测定。结果显示,樱桃谷鸭42日龄胸肌重达205 g,腿肌重达238 g,其肌纤维面积分别是5835 μm2和12406μm2,而莆田黑鸭(白羽系)42日龄胸肌重仅为129g,腿肌重175g,其肌纤维面积分别是926 μm2和4089 μm2,表明樱桃谷鸭与莆田黑鸭(白羽系)在胸肌、腿肌发育和肌纤维发育等方面差异显著。2.为构建鸭miRNA-1和miRNA-133的组织表达谱和发育性表达谱,本文通过实时荧光定量检测樱桃谷鸭和莆田黑鸭(白羽系)的miRNA-1和miRNA-133表达量。检测结果显示,miRNA-1和miRNA-133在心肌、胸肌和腿肌等肌肉中呈特异性表达。同时检测胚胎期和早期生长发育过程中的肌肉组织miRNA的表达量,发现鸭胸肌和腿肌miRNA-1和miRNA-133的表达呈现出类似的变化趋势,即在胚胎期后期miRNA表达急剧上升,而在整个生长发育期miRNA的表达基本恒定。樱桃谷鸭中表达量分别在胚胎期28天和生长期42天达到峰值,且在这两个时间点,樱桃谷鸭的表达量显著高于莆田黑鸭(P<0.05)。3.为探明鸭miRNA-1和miRNA-133对骨骼肌发育的作用,将miRNA-1 mimic或inhibitor和miRNA-133 mimic或inhibitor转染至鸭成肌细胞,实时荧光定量检测结果显示,miRNA mimic或inhibitor可有效促进或抑制其表达;且过表达miRNA-1可促进相邻成肌细胞相互融合,而过表达miRNA-133细胞融合现象很少;CCK-8细胞增殖检测结果表明,降低miRNA-1表达可促进成肌细胞增殖,而降低miRNA-133则可抑制成肌细胞增殖;成肌细胞分化标记标志基因表达检测结果显示,转染miRNA-1 mimic,分化标记标志基因MEF2d、Myod表达量显著地上升,而转染miRNA-133 inhibitor,MEF2d、Myod基因的表达量显著地上升。以上结果充分说明miRNA-1可促进鸭成肌细胞分化,miRNA-133可促进成肌细胞增殖。4.为进一步阐明miRNA-1和miRNA-133在鸭骨骼肌发育中的作用机制,通过文献检索和生物信息学预测,确定miRNA-1和miRNA-133的候选靶基因。实时荧光定量检测转染miRNA的模拟物和抑制物之后候选靶基因的表达量,结果显示miRNA-1可显著降低其候选靶基因HDAC4的表达(P<0.01),miRNA-133也可降低其候选靶基因SRF、TGFBR1的表达(P<0.01)。双荧光素酶报告系统进一步检测结果表明,miRNA-1可抑制pGL-Basic-HDAC4荧光素酶报告基因活性;而miRNA-133并未降低pGL-Basic-SRF,pGL-Basic-TGFBR1荧光表达强度。因此,鸭miRNA-1可通过靶向HDAC4促进鸭成肌细胞分化;而miRNA-133可影响SRF、TGFBR1的表达,并促进鸭成肌细胞增殖。