平邑甜茶GLB1基因的克隆、表达及其功能的研究

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模式植物研究发现GLB1编码非共生血红蛋白,该蛋白的主要功能包括以下几个方面:(1)因为和氧的亲和力强,所以可能起到清除氧的作用。(2)通过与黄素蛋白(类似于细菌和酵母体内的黄素血红蛋白)的相互作用用参与电子传递。(3)结合一些已知的配体(O2,NO和CO),作为感受机制的一部分,比如针对配体水平的波动而调节细胞内的代谢。(4)与有机小分子结合,在脂肪酸的运输中起作用或者参与低氧条件下的有机物的合成。为探讨GLB1在果树抵抗非生物胁迫中的分子生物学功能,以水培平邑甜茶实生苗为试材,克隆了非共生血红蛋白-1的编码基因,同时采用实时荧光定量PCR研究了MhGLB1基因在NO3-、SNP、低氧胁迫及ABA处理下表达量的变化,并构建了MhGLB1的正义表达载体,成功转化了番茄,初步研究了其生理生化功能,主要结果如下:1.根据已知苹果GLB1基因的EST序列,设计特异引物利用PCR技术获得非共生血红蛋白-1的全长编码区,命名为MhGLB1,GenBank注册号为GQ423619。序列分析表明,MhGLB1基因编码区477bp,共编码158个氨基酸,预测分子量为17.8kDa。同时MhGLB1的氨基酸序列分析显示该基因与梨(Pyrus communis)、棉花(Gossypium hirsutum)、苜蓿(Medicago sativa)的非共生血红蛋白的同源性分别为95.57%、82.82%、80.12%;系统进化树分析显示,MhGLB1基因与梨的同源关系最近。故进一步确定其为平邑甜茶非共生血红蛋白-1的编码基因。2.荧光定量PCR分析MhGLB1基因在不同组织中的表达发现,MhGLB1在平邑甜茶的根、茎、叶中均有表达,且在根中的表达量最大。对MhGLB1基因在不同环境条件下在不同组织中的表达特性的研究结果显示:硝态氮处理增加了MhGLB1在根、茎、叶中的表达,且在根中MhGLB1的含量2h时就明显升高,茎和叶中MhGLB1的表达量是缓慢增加的;在SNP处理下,MhGLB1的表达量2h时已迅速增加,4h时表达量比峰值下降50.8%,但仍高于对照,之后又有所增加;ABA处理4h能够使MhGLB1的含量显著高于对照,用c-PTIO预处理后再用ABA处理时,MhGLB1的含量与对照差异不显著。3.为进一步研究平邑甜茶GLB1的生理生化功能,将非共生血红蛋白-1的编码基因,构建了pBI121- MhGLB1正义表达载体,并对番茄进行农杆菌侵染的遗传转化。对转基因番茄的抗涝性进行了初步检测发现:与野生型植株(WT)相比,转基因番茄(1号和5号)在水涝下其光合速率下降比较缓慢。在淹水24h时野生型植株光合速率、气孔导度、蒸腾速率分别下降了86%、86.8%和90.7%,而转基因植株1号和5号则分别下降了40.1%、72.5%、78.7%以及55.3%、70.2%、82.8%,96h时H2O2和NO的含量也都显著低于对照。
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