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β-防御素是近年来发现的一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽，富含精氨酸和二硫键，β-防御素在人类中主要包括HBD-1、HBD-2、HBD-3、HBD-4、HBD-27、HBD-28，分布在各种粘膜和表皮细胞。以上各类防御素都具有很强抑菌活性，在天然性免疫和获得性免疫中发挥着重要的作用。研究发现HBD-3与其它的防御素相比，不具有明显的细胞毒性，对盐离子浓度不敏感，且作用于微生物细胞膜的防御机理以及不易引起耐药性的特点已引起各国研究者的日益重视。
本研究旨在选择系列β-防御素类化合物，研究其生物活性及活性与结构之间的对应关系，进行定量构效关系的研究，建立有效的QSAR模型。为设计合成表达量高、抑菌能力强的人β-防御素3基因序列提供理论依据，并指导设计合成基因，使其在真核生物中表达。为人β-防御素3的进一步研究、大量生产和实际应用打下基础。
(1)优化人β-防御素3基因的设计：通过计算机量子化学等进行构象分析，寻找多肽的效应团，设计得到活性更高，更稳定的防御素。本实验中利用Hyperchem7.0软件包的量子化学半经验方法对20个具有代表性的β防御素类似物进行了量子化学计算研究了它们的结构参数并建立定量构效关系模型。结果显示，防御素的活性和疏水度、分子范德华面积、分子体积、净电荷线性相关。LogP对防御素影响不大，侧链的疏水基团能增加多肽的抗菌活性，在设计防御素基因时，结构上应采用管状空间结构，性质上充分考虑其两亲性，可采用正电性的赖氨酸或精氨酸与负电性的谷氨酸和天冬氨酸搭配，疏水性苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸搭配，以提高抗微生物肽的活性。该模型对同类化合物有较好的预测能力，可用于指导新型β防御素的设计与优化。在GenBank中检索得到HBD-3的氨基酸序列基础上，以构效关系模型为指导，对组成的结构氨基酸进行调整，并根据酵母遗传密码子偏爱性，考虑其全基因中碱基含量的平衡，借助DNAsis软件，对其中的密码子再行调整，消除不合适的密码子串联组织、限制性核酸内切酶位点和潜在的空间结构，从而设计出优化的人β防御素3基因序列为：5’GGTATCATCAACACTTTGCAAAAGTACTACTGGAGAGTTAGAGGTGGTAGATGGGCTGTTTTGTCCTGGTTGCCAAAGGAGGAGCAAATCGGTAAGTGGTCCACTAGAGGTAGAAAGTGGTGGAGAAGAAAGAAG3’
(2)优化人β-防御素3基因的合成：本实验采用酶促方法，设计搭桥引物合成优化人β-防御素3基因。首先合成末端之间有15个互补碱基的寡核苷酸片段，退火后以重叠区作为引物，在四种dNTP存在的条件下，通过TaqDNA聚合酶的作用，获得完整互补的双链。引物的两端带有EcoR I和SalI酶切位点。 (3)优化的人β防御素3基因在Pichia pastoris中的表达：把设计合成的人β-防御素3基因经过双酶切后与载体pPICZa-A连接，连接产物转化到E．coli DH5a中。在含25μg/mL Zeocin的低盐LB平板上筛选阳性单菌落，经酶切、PCR、测序确认。获得的含优化的人β-防御素3基因的重组表达载体大量扩增，抽提质粒，通过电击法转化酵母菌GS115，在含100μg/mL Zeocin的YEPD平板上筛选阳性单菌落，经PCR确认阳性克隆，甲醇诱导，上清液经。Tricine-SDS-PAGE电泳证实优化的人β-防御素3基因已整合到酵母基因组上。
(4)目的蛋白的纯化：大量扩增可溶性优化的人β-防御素3基因酵母表达载体转化阳性的毕赤酵母GS115菌株，收集上清，利用Ni-NTA Agarose亲和层析柱纯化获得重组可溶性HBD-3蛋白，用Tricine-SDS-PAGE检测纯化产物，结果表明：转化阳性克隆子的毕赤酵母GS115菌株成功表达了分子量为6.5kD的可溶性HBD-3蛋白，经过Ni-NTA Agarose亲和层析柱纯化，Tricine-SDS-PAGE鉴定显示获得了高纯度的重组可溶性HBD．3蛋白，培养上清总蛋白产量达186μg/mL。
(5)表达产物抑菌活性的测定：抑菌活性的比较实验中表明，优化的人β-防御素3基因与原始的人β-防御素3在对抗革兰氏细菌方面，优化了的基因显示了更明显的抗菌活性，但在对真菌的抑制方面，两者并没有明显的差别。