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研究背景：凝血因子Ⅴ（FⅤ）是一种分子量为330KD的单链糖蛋白，对凝血和抗凝平衡的维持具有重要的作用。它是由3个同源的A区、2个同源的C区及1个高度糖基化的B区连接而成，顺序如下：A1-A2-B-A3-C1-C2。重链由A1和A2区段组成，轻链则包含A3区、C1区和C2区。近年来，人们已完全解码了FⅤ基因的全长序列（GenBank 序列号Z99572），它定位于染色体1q23，跨度达80Kb以上，有25个外显子。FⅤ mRNA编码28个氨基酸的前导肽和2196个氨基酸的成熟蛋白质。其中1到12号外显子、14到25号外显子及13号外显子分别负责编码FⅤ分子的重链、轻链和B区。先天性凝血因子Ⅴ缺陷症即副血友病，由Owren于1947年率先报导，是一种少见的常染色体隐性遗传性出血性疾病。其估计的发病率为1/1000000。先天性FⅤ缺陷症的临床表现差异很大，一般仅纯合子有出血表现，杂合子通常无出血症状。随着对FⅤ分子基础研究的深入，使人们有可能在分子水平对先天性V因子缺陷症进行研究，并发现了数种FⅤ基因的突变类型。这些分子发病机制的阐明将有助于进一步剖析先天性因子V缺陷症临床表现的差异，并为最终治愈这种疾病奠定基础。目的：介绍两例先天性凝血因子Ⅴ缺陷症的诊断过程和治疗结果，观察先天性凝血因子Ⅴ缺陷症的遗传规律，探讨在较重大手术时的围手术期处理方案；研究两例先天性凝血因子Ⅴ缺陷症先证者的分子发病机制，并在家系研究中进一步进行证实。同时，明确所发现的异常FⅤ基因是否为正常人群中的多态性。实验方法：PT（凝血酶原时间）、 APTT （活化部分凝血活酶时间）、TT （凝血酶时间）及凝血因子活性检测采用DADE Bchring公司试剂盒，于CA-1500全自动凝血测定仪上进行。FⅤ抑制物检测参照Bethesda法。并对两例先天性凝血因子Ⅴ缺陷症的家系进行了调查。通过输注新鲜冻干血浆，对其中一例患者的硬膜外血肿进行了清除。按GenBank已发表的DNA序列（Z99572），设计合成扩增FⅤ基因25个外显子的特异性引物（引物位于各内含子区，以确保能扩增出FⅤ基因的剪接位<WP=4>点）。用DNAZOL分离外周血单个核细胞基因组DNA，并进行PCR。PCR产物经胶回收纯化试剂盒纯化后，于ABI 377 DNA测序仪上直接测序或T-A克隆后再行测序（13号外显子）。测序结果与GeneBank已知的DNA序列比较，对比正反向测序和不同次PCR产物的测序结果，明确FⅤ基因的突变位点。用限制性内切酶证实变的FⅤ基因在患者家系成员中的分布情况，并在正常对照人群中进行了多态性分析。实验结果：两例患者确诊为先天性V因子缺陷症（纯合子）。患者A父母、患者B的母亲和儿子均为先天性V因子缺陷症杂合子型。从两位患者的家系的初步调查结果分析，也表明符合常染色体隐性遗传规律。患者A经新鲜冻干血浆替代治疗后，成功进行了硬膜外血肿清除术。通过对两个有明显出血表现的先天性因子V缺陷症家系的初步研究，鉴定到两个新的FV基因突变类型：患者A的第8号内含子3’端剪接位点存在A→G的纯合子突变；患者B在第18号外显子相当于mRNA（M16967）5729位置上存在C→A 的纯合子突变，相应的氨基酸变异为Pro1880Gln。它们在家系研究中已被进一步证实。我们所鉴定到两个新的FV突变基因，经文献检索未见类似报道。鉴于先期研究证实的所有FV变异均集中于外显子编码区，因此位于内含子剪接区的FⅤ基因突变的发现，首次证实了先天性凝血因子V缺陷症的另一种新的分子发病模式。我们还发现FV基因外显子2在327A→G，Gln79、外显子8在1332A→G，Lys414，它们均为沉默突变（M16967）；在第16号外显子编码区下游+12nt的位置上（第17号内含子）A→G的突变是一种多态性。另外，也证实了先期的研究，即外显子16编码区5380 C→T（M16967），导致的His1764Tyr；在第17号外显子编码区上游-6～-5 nt、-9～-8 nt、-26～-25 nt的位置上 （第16号内含子）分别发生Insertion CT、 Insertion T 和Insertion T也是一种多态性。结论：两个新的FⅤ基因变异与先天性V因子缺陷症的发病有关。