发酵产延胡索酸酶条件优化、发酵动力学及酶学性质研究

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L-苹果酸是一种安全无毒无害的食用有机酸,是继柠檬酸、乳酸之后的世界第三大酸味添加剂,在食品、医药、日用化工及保健等领域应用广泛。酶转化法是目前L-苹果酸的工业化生产的主要方法。因此,对延胡索酸酶发酵的条件、动力学及酶学性质进行研究,将为发酵放大工艺控制、提高生产水平、降低生产成本等提供实验参数及理论指导。  论文对具有自主知识产权的产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)MA-2菌株发酵条件及发酵培养基进行优化,首先利用单因素法优化发酵条件,最终确定最适种龄24 h,最适温度为34℃,最适初始pH值为7.5,最适接种量为8%,最适装液量为50/250 mL,最适转速为180 r/min。在最优反应条件基础上,采用单因素优化培养基中的碳源、氮源和无机盐。利用Plackett-Burman实验筛选到影响延胡索酸酶活力的主要因素,并通过爬坡实验确定主要因素合适的范围。最后,利用根据CCD设计原理,进行响应面分析实验确定三个因素之间的最佳组合。建立了酶活对三种因素响应的三元二次回归方程:  酶活(U/mL)=-171.17896+3.94407A+13.88514B+434.96996C+0.037992AB+1.22538AC+6.89442BC-0.16020A2-0.31794B2-648.42549C2。通过软件Design-Expert7.1.6对方程进行优化求解得到相应培养基值:葡萄糖17.11 g/L,玉米浆29.57 g/L,MgSO4·7H2O0.47g/L。此时的酶活达28329 U/mL,较优化前提高46.1%。为检验响应面法所得结果的可靠性,采用上述培养基条件重复实验3次,酶活实测平均值为28411 U/mL,与理论预测值吻合程度良好。最终确定最适发酵培养基配方:葡萄糖17.11 g/L,玉米浆29.57 g/L,MgSO4·7H2O0.47g/L,柠檬酸5g/L,KH2PO42g/L。  在对发酵培养基及发酵条件优化基础上,研究延胡索酸酶发酵动力学,并分别使用Monod模型、Logistic模型及Gompertz模型对产氨短杆菌菌株的生长过程进行了拟合,其R2(适用度)分别为:0.6888、0.9982及0.99655,Logistic模型适用性最好。对底物消耗及产物生成过程进行分析,分别用Luedeking-Piret和Luededing-Piret-like模型进行拟合,适用性较好。对建立的三种动力学模型在3L发酵罐中进行了适用性验证,结果证明模型能较好的适用于产氨短杆菌发酵的放大过程。  对延胡索酸酶初步的分离纯化方法进行研究。利用超声破碎、硫酸铵分级沉淀和Sephadex G-200,经过几步纯化后延胡索酸酶比活力达106 U/mg,纯化倍数达12.8倍,回收率为24%。同时,研究了延胡索酸酶的理化性质,延胡索酸酶的最适反应温度为35℃,最适反应pH为7.0,Mg2+对延胡索酸酶具有激活作用,Ca2+的加入对酶活没有影响,相反,Cu2+、Zn2+加入则抑制酶活。
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