糖代谢调控蛋白SugR对谷氨酸棒杆菌合成l-鸟氨酸和l-瓜氨酸的影响研究

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L-鸟氨酸和L-瓜氨酸是精氨酸合成代谢途径的中间代谢产物,虽然这两种氨基酸不参与蛋白质的合成,但其在食品、医药等领域的应用日趋重要。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种高GC含量的革兰氏阳性菌,被广泛用于多种氨基酸的工业生产(谷氨酸和赖氨酸等)。随着现代工业生物技术的发展以及C.glutamicum ATCC13032的全基因组测序工作的完成,通过代谢工程改造谷氨酸棒杆菌构建高产氨基酸菌株的方法已被广泛应用于以发酵工业为主的生物制造中。本课题以合成L-鸟氨酸和L-瓜氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株为研究对象,研究谷氨酸棒杆菌糖代谢全局调控蛋白SugR在其发酵产氨基酸时的作用,主要结果如下。  (1)通过Genbank查找C.glutamicum ATCC13032中sugR基因序列,克隆出同源臂缺失的sugR基因片段,构建重组质粒pK18mobsacB-sugR,通过电转化法导入到实验室已有的C.glutamicum1006和C.glutamicum ATCC13032△argG△argR中,经过双交换后得到重组菌株,经过琼脂糖凝胶电泳检测后sugR基因的片段大小由原来的1600bp减少到860bp,证明sugR基因敲除成功,得到重组菌株 C.glutamicum1006△sugR和 C.glutamicum ATCC13032△argG△argR△sugR。  (2)将实验室保藏的鸟氨酸高产菌C.glutamicum1006基因组与C.glutamicum ATCC13032进行序列比对,确定了其突变位点。将构建好的重组菌C.glutamicum1006△sugR(Orn2)和对照菌C.glutamicum1006(Orn1)进行摇瓶发酵实验,在不同培养基中Orn1和Orn2的氨基酸产量和菌体生长量基本相同,糖耗速率(g/h)由1.07、0.74和1.11提高到了1.21、0.82和1.29,分别提高了13.1%、10.8%和16.2%,在以糖蜜为碳源时糖耗速率由1.11g/h提高到1.21g/h,提高了9.2%。  (3)将实验室已有的pXMJ19-argB(ec)质粒导入到敲除sugR基因的重组菌中,得到高产L-瓜氨酸的缺失sugR基因的菌株C.glutamicum ATCC13032△argG△argR△sugR-pXMJ19-argB(ec)(Cit3),将重组菌和对照菌C.glutamicum ATCC13032△argG△argR-pXMJ19-argB(ec)(Cit2)进行摇瓶发酵实验,在以不同碳源(葡萄糖、果糖和蔗糖)的发酵培养基中Cit2和Cit3的氨基酸产量和菌体生长量基本相同,糖耗速率(g/h)由1.21、1.11和1.14提高到1.48、1.25和1.33,分别提高了22.3%、12.6%和16.7%,在以糖蜜为碳源时糖耗速率由1.18g/h提高到1.29g/h,提高了9.35%。
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