论文部分内容阅读
研究目的：肿瘤组织中的KRAS基因突变是转移性大肠癌患者使用EGFR单克隆抗体以及非小细胞肺癌患者使用EGFR-TKI无效的重要的分子标志物。但随着肿瘤的发展,肿瘤的基因突变状态有可能发生改变,因此,原发灶中的基因突变状态并不能-直反映转移灶肿瘤的基因突变状态。本实验的主要目的有：(1)选择并建立一种便捷的检测肿瘤患者外周血浆KRAS基因突变的检测技术,并将血浆中KRAS基因突变检测结果与肿瘤组织中的检测结果相比较；(2)建立一种能对血浆KRAS基因突变进行定量的检测技术,为以后定量检测血浆KRAS基因突变以指导肿瘤个体化治疗,“实时”调整用药提供技术平台。研究方法：选择并建立COLD-PCR和PNA-PCR法,将KRAS基因突变细胞系DNA按照一定比例稀释到KRAS野生型DNA中,分别行COLD-PCR和PNA-PCR法检测突变,获得两种方法检测KRAS基因突变的敏感性。采用两种检测方法分别检测19例胰腺癌患者血浆中KRAS基因突变并将血中的检测结果和组织中的检测结果比较。采用PNA-PCR法检测100例大肠癌患者血浆中KRAS基因突变,并将血浆的检测结果与组织中的检测结果相比较。实验结果：体外细胞系实验表明COLD-PCR/焦磷酸测序法检测KRAS基因突变的敏感性为0.5%,比普通PCR／焦磷酸测序法的检测敏感性提高了10倍(5%)。PNA-PCR/焦磷酸测序法检测KRAS基因突变的敏感性为1：5000(突变型：野生型),且能完全抑制野生型DNA的扩增而不抑制突变型DNA的扩增,因此具有对血浆突变KRAS基因定量的潜力。19例胰腺癌患者的肿瘤组织中共有16例患者检出了存在KRAS基因突变(突变率84.2%)。 COLD-PCR法能从血浆中检测出2例KRAS基因突变,且检出的突变类型与肿瘤组织中的突变类型相符。PNA-PCR法能从19例胰腺癌患者血浆中检出14例KRAS基因突变,其中有13例突变类型与组织中的突变类型相符,另外有1例术后多次化疗后患者肿瘤组织和血浆中分别检出了不同的KRAS基因突变类型。总的来说,PNA-PCR法检测血浆KRAS基因突变与组织相比吻合率为82.4%。100例大肠癌患者的肿瘤组织中共有49例标本检出了存在KRAS基因突变(突变率49%)。PNA-PCR法能从100例大肠癌患者血浆中检测到38例KRAS基因突变。其中有30例血浆标本中检出的KRAS基因突变类型与组织中检出的突变类型相符。17例标本组织中存在突变但血浆中检测不出,另外有6例标本肿瘤组织中未检出KRAS基因突变但血浆中却检测出存在突变(其中有2例是同义突变)。总的来说,100例大肠癌患者血浆和肿瘤组织的KRAS基因突变状态的吻合率为75.0%。结论：本实验我们建立了检测灵敏性高特异性好的能检测血浆游离KRAS基因突变且具有对血浆突变KRAS基因进行定量潜力的PNA-PCR检测技术。该技术从肿瘤患者血浆中检测到的KRAS基因突变状态与肿瘤组织中的突变状态有较好的一致性。PNA-PCR法还能从血浆中检测出肿瘤组织检测不到的KRAS基因突变或突变类型,提示血浆中的检测可能比肿瘤组织中的检测更有价值。