D1蛋白酶PDZ结构域蛋白的克隆、表达及性质研究

• 作 者: 李燕琼
• 机 构: 华中师范大学
• 出 处: 华中师范大学
• 发表日期: 2012年期
• 关键词: PDZ结构域 免疫吸附 等温滴定量热 抗原表位 D1蛋白酶 基因克隆

D1蛋白酶是一种膜蛋白，在进行光合作用时，D1蛋白酶剪切D1蛋白前体的C端延伸端使之转化为成熟的D1蛋白，是光合作用系统中必不可少的一种酶。并且广泛存在于植物体内，具有很高的同源性，并且含量少，被认为是一种新型的除草剂作用靶标蛋白。D1蛋白酶的晶体主要由A、B、C三个松散的区域折叠而成，有研究结果证实D1蛋白酶中的B区域包含有一个PDZ结构域。在很多高等真核生物中，PDZ结构域是作为蛋白质与蛋白质之间的相互作用模块，调控着很多与生物学现象相关的作用模式，因此PDZ结构域也被认为是潜在的药物靶点。　　
为了研究D1蛋白酶PDZ结构域的功能和性质，本文利用基因工程的方法，通过聚合酶链式反应(PCR)从CtpA基因中扩增得到PDZ结构域基因。用NdeⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点将其组装至表达载体pET-28a中，构建了PDZ结构域蛋白相应的重组表达载体，将构建的表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，用IPTG低温诱导后得到可溶形式表达的PDZ结构域蛋白。　　
在此基础上，采用高效液相色谱法、免疫吸附法、表面等离子共振法、等温滴定量热法等多种化学以及生物学方法对PDZ结构域的免疫学活性、催化活性以及与抗体结合的热力学性质进行了研究。结果表明：PDZ结构域蛋白能与D1蛋白酶的抗体相结合，具有免疫活性，证实了PDZ结构域是D1蛋白酶中的结合位点；活性测定结果表明PDZ结构域蛋白也能催化水解模拟底物24肽，证实了PDZ结构域蛋白同时也是D1蛋白酶的催化活性位点，其活性约为D1蛋白酶的60％，米氏常数为91.9μM；等温滴定微量量热法测定结果表明PDZ结构域蛋白、D1蛋白酶与抗体以1:1的摩尔比相结合，是以焓驱动为主的焓-熵协同驱动的过程。