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壳聚糖是一种天然的阳离子多糖,具有良好的生物可降解性、低毒性、良好的生物相容性以及较低的免疫原性等优点。同时,由于壳聚糖自身带有较多的氨基基团荷正电,能够与负电性的DNA通过静电吸引作用结合在一起,具有保护DNA免受核酸酶酶解解的作用,这些优点使壳聚糖成为非病毒型基因载体具有良好的应用前景。但是壳聚糖本身较低的水溶性和转染效率阻碍了其作为基因载体的应用,所以开发具有较高水溶性和转染效率的壳聚糖衍生物作为基因载体的研究势在必行。
本研究工作主要包括以下内容:
借助强氧化和机械超声作用制备了小粒径的纳米壳聚糖,通过与环氧乙烷反应形成了O-羟乙基化纳米壳聚糖,对其结构分别运用了核磁共振,傅里叶红外光谱,透射电子显微镜,原子力显微镜等方法进行了表征,结果证明该纳米颗粒平均粒径为30nm左右,粒径分布均匀,并且表面被羟乙基所修饰。
通过对HEK293,HepG2和NIH-3T3三种细胞的毒性试验检验了O-羟乙基化壳聚糖作为基因载体的生物相容性。MTT实验结果表明,上述三种细胞经过O-羟乙基化修饰的纳米壳聚糖处理24h后,即使在壳聚糖浓度高达2.mg/mL时,三种细胞的存活率均在80%以上,而同样条件下PEI处理的三种细胞的存活率接近为零。该结果表明,与PEI相比,羟乙基修饰的壳聚糖展现了良好的生物相容性和低毒性的特点,具有应用于活体转染的潜力。
分别在HEK293,HepG2和NIH-3T3细胞中研究了O-羟乙基化纳米壳聚糖作为基因载体的体外转染增强型绿色荧光蛋白的效率,并以PEI(聚乙烯亚胺)作为阳性对照,比较了不同的w/w时的转染效率。结果表明:HEK293细胞在w/w为4:1时达到最大,然后随着质量比的增加而减小,最高转染效率可达56.09±1.91%。该结果证明在一定范围内,随着w/w的增加,转染效率逐步增加。对NIH-3T3和HepG2细胞而言,当其质量比达到8:1时,其转染效率均达到最高值,分别为57.57±2.429%和65.44±2.742%。