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本研究以植物一氧化氮合成酶关联因子(nitric oxide synthaseassociated,NOA)为切入点,利用NOA突变体Atnoa1作为实验材料,研究了内源一氧化氮参与并调节拟南芥盐胁迫应答反应的生理生化基础。鉴于NOA在植物中的重要作用,我们通过电子克隆并结合RT-PCR、3’RACE技术,获得了马铃薯一氧化氮合成酶相关因子(StNOA1)cDNA全长序列,分析了马铃薯NOA基因的序列结构,并对该基因进行原核表达。通过农杆菌介导的方法,将StNOA1基因转入拟南芥NOA基因突变体植株,获得了转基因纯合株系。初步验证了StNOA1基因在植物抗盐胁迫应答过程中功能。主要结论如下:
1.内源一氧化氮减轻了盐胁迫条件下拟南芥受到的生长抑制、渗透胁迫,并且调节拟南芥叶片抗氧化酶活性,从而减轻盐胁迫下活性氧的伤害,另外,一氧化氮也作为一种活性氧清除剂提高了拟南芥的抗盐性。
2.从马铃薯中首次克隆到NOA(nitric oxide synthase associated)基因,命名为StNOA1,已登录到GeneBank,登录号(GBANa):GU205181。
3.StNOA1包含了5’UTR(Untranslated Region)和3’UTR,其cDNA全长为1929bp,其中的开放阅读框(Open Reaaing Frame,ORF)编码了由561个氨基酸组成的蛋白质,预测其蛋白分子量为60 kD。
4.StNOA1与烟草(Nicotiana benthamian),葡萄(Vitis vinifera),蓖麻(Ricinus communis),水稻(Oryza sativa),玉米(Zea may)以及拟南芥(Arabidopsis thaliana)均有很高的同源性(89.44％～63.56%)。它们之间的高度相似性主要表现为中间部位序列的高度保守,其下游和上游的氨基酸序列中一致性降低。
5.StNOA1的中间高度保守区域包含了一个GTPase-specific的特征结构域:KxD(the GTP specificity motif),GxxxxGKS(Walker A),DxxG(Walker B),并且和烟草、葡萄、蓖麻、水稻、玉米以及拟南芥NOA在此区域序列完全相同。
6.对烟草、葡萄、蓖麻、水稻、玉米以及拟南芥及马铃薯NOA的全长氨基酸序列进行系统发生分析,结果显示马铃薯和烟草的NOA序列具有高度同源性,在进化上明显处在同一分枝上,水稻和玉米则处在与其相近的另一分支,而拟南芥和蓖麻则处于同一分支;葡萄则处在另一分支。
7.StNOA1原核表达的蛋白分子量和预测分子量相吻合,为60 kD。但是表达蛋白在上清中很少,大部分以包涵体形式出现。所以用8 M尿素溶解包涵体,使其变性,然后透析复性,获得了可溶性目的蛋白,用300 mmol/L咪唑成功地对StNOA1原核表达产物进行Ni-NTA柱亲和层析纯化。
8.获得了四个转StNOA1基因的转基因纯合株系。四个转基因纯合株系中StNOA1的表达各不相同,其中TL9表达最强。
9.StNOA1在拟南芥NaCl胁迫应答反应过程中发挥了重要作用,提高了拟南芥的抗盐能力,表现为在NaCl胁迫下能促进拟南芥根伸长、提高幼苗成活率、提高脯氨酸积累、降低丙二醛含量、提高叶绿素和可溶性蛋白含量。
对StNOA1的进一步研究有助于提高农作物抗逆反应的能力,为作物抗逆的分子育种工作提供分子生物学基础。