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拟除虫菊酯类农药的广泛施用导致了生态环境恶化和食品中该类农药超标等问题,危害人们身体健康的同时,严重威胁到农副产品生产和加工,影响我国现代农业可持续发展。此类农药作为目前最有发展前途的杀虫剂,在尚未找到新型替代物之前,未来一段时间内仍将被广泛使用,因而,寻求降低和消除其残留的方法尤为必要。生物修复因条件温和且效率较高,已成为近年来国内外解决农药残留问题研究热点。因此本研究以氯氰菊酯代表拟除虫菊酯类农药作为研究对象,从受其污染的茶园和果园土壤及农药厂污泥中分离筛选对氯氰菊酯有降解作用的益生菌株,考察其特性,侧重研究对菌株降解氯氰菊酯的培养基组分、培养条件优化及其氯氰菊酯降解酶分离纯化。
1氯氰菊酯降解菌的分离鉴定和特性研究分离得到了6株对氯氰菊酯具有降解作用的菌株(A-4、T-2、D-8、B-1、B-8和B-12),其中B-1、B-8和B-12为芽孢杆菌。6株菌中120 h对100 mg/L氯氰菊酯降解率最高者为B-1,达52.91％。根据《伯杰细菌鉴定手册》对B-1形态、生理生化特征进行鉴定,并结合16S rDNA序列分析(GenBank数据库中B-1登录号为HQ009796),将B-1鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis B-1)。
以小白鼠为试验对象,B-1活菌培养液经口的LD50大于15,000 mg/kg BW,根据GB15193.3-2003《食品安全性毒理学评价程序和方法》判定为实际无毒,同时地衣芽孢杆菌为“公认安全(GRAS)”菌,因此,B-1是益生菌。无毒的地衣芽孢杆菌B-1的获得丰富了氯氰菊酯降解菌种资源库,为应用于环境和农产品生产中消除和降低氯氰菊酯提供了基础材料。
从B-1降解氯氰菊酯的特性研究来看,B-1在只含氯氰菊酯及其溶剂的基础盐培养基中,对氯氰菊酯无降解。在酵母膏、蛋白胨存在下,其120 h降解率为52.91％,表明B-1以共代谢方式降解氯氰菊酯;对100 mg/L氯氰菊酯240 h降解率达70.35％;对100 mg/L溴氰菊酯、氟氯氰菊酯和氰戊菊酯120 h降解率分别为46.12％、39.69％、23.48％;对氯氰菊酯降解作用源于其所产生降解酶,且降解酶不需氯氰菊酯诱导,在细胞内外均存在,其中大部分存在于胞外。降解氯氰菊酯胞外酶的发现,尚属首例。
2 B-1降解氯氰菊酯的培养基组分和降解条件优化采用Plackett-Burman设计,结合响应面分析,对B-1降解氯氰菊酯的培养基成分和降解条件进行快速全面优化。结果发现氯氰菊酯浓度、葡萄糖含量和种龄是影响B-1降解氯氰菊酯的显著因素。优化后培养基组分为:蛋白胨1％、酵母膏0.125％、葡萄糖0.213％、氯化锰0.0625％、吐温800.2％、NaCl1％,氯氰菊酯浓度为16.5 mg/L。培养条件为:pH7.5、种龄为33.13 h、接种量6.25％、装液量30 mL、转速180 r/min、37℃培养72 h。在此培养条件下B-1对氯氰菊酯理论最大降解率为94.26％,验证实验为94.12％,说明预测值和实测值拟合性较好。对B-1降解氯氰菊酯培养基组分和条件的优化,为菌株应用于农产品生产环境中消除氯氰菊酯提供了基础参考。
3 B-1的氯氰菊酯降解酶纯化对B-1的48 h发酵液经10,000 r/min离心5 min收集上清,用30％硫酸铵初步盐析后取上清,再用70％硫酸铵二次盐析后得沉淀、透析、DEAE-Cellose阴离子交换层析和Sephadex G-100凝胶柱层析后,氯氰菊酯降解酶比活达50.42 U/mg,纯化倍数达23.03,回收率为8.38％。非变性PAGE结果表明纯化后产物是单一条带,且具有酯酶活性。SDS-PAGE结果表明纯化产物的分子量约为66.4 Kda。对B-1氯氰菊酯胞外降解酶的纯化研究为酶法降解应用于食品加工过程消除氯氰菊酯残留提供了基础数据。
论文研究结果不仅可为深入研究地衣芽孢杆菌B-1及其氯氰菊酯降解酶奠定理论基础,而且可为消除环境和食品中拟除虫菊酯类农药残留提供有价值的参考数据,具有一定的理论意义和实际应用价值。