维甲酸诱导腭裂胚鼠孕期14.5天circRNA差异性表达谱的筛选

• 作 者: 梁伟杰
• 机 构: 汕头大学
• 出 处: 汕头大学
• 发表日期: 2019年1期
• 关键词: 先天性唇腭裂

研究目的：
　　1、利用维甲酸建立昆明小鼠腭裂模型，为继续探索先天性唇腭裂的致病机制提供动物模型。
　　2、运用高通量测序的技术探索维甲酸诱导组的胚鼠与正常组胚鼠腭部组织的circRNAs的差异表达情况。
　　3、结合本课题组前期预测的在腭裂胚鼠腭部组织的显著差异性表达microRNA及相关靶基因结果，构建可能存在的显著差异表达的circRNA-microRNA-靶基因网络，推测差异表达的circRNA在胚鼠腭裂形成中的生物学功能。
　　研究方法：
　　1、在昆明小鼠孕鼠孕期第10.5天时，实验组予以维甲酸按照70mg/kg的剂量灌胃，对照组使用相同体积的玉米油灌胃处理。实验组与对照组孕鼠在孕期第14.5天以颈脱位后处死，解剖获取胚鼠及器腭部组织，统计腭裂胚鼠的数量及其发生率。再通过高通量测序技术检测两组孕期第14.5天胚鼠腭部组织的circRNAs。
　　2、circRNA高通量测序样本准备及数据处理：在无菌无RNA酶的条件下提取两组孕期第14.5天小鼠腭部组织研磨成粉状，并保存于含有RNA保存试剂的试管中，其中实验组3管，对照组3管备用。用干冰覆盖后保存良好后，备后续进行高通量测序：用Triol法提取样本中的总RNA,借助超微量核酸蛋白测定仪(scandrop100)测量样本RNA的A260/A280比值进行样本RNA质量控制，纯度鉴定。利用DNase及RNase消除法去除样本中残留的DNA及线性RNA,建立去rRNA的文库，然后使用IlluminaHiSeqX-10高通量测序平台进行测序。测序结果经R语言包处理后，以FC大于4和P-vaule小于0.01为筛选标准筛选差异表达circRNA。
　　3、结合本课题组前期预测的在腭裂胚鼠腭部组织显著差异表达的6个microRNA及相关靶基因结果，运用starBase数据库的miRNA-circRNA功能对6个microRNA进行检索，采集数据库中每个microRNA对应的具有碱基结合位点的所有circRNA数据。再将检索结果与获得腭裂胚鼠腭部组织中显著差异表达的circRNA结果进行比较筛选。筛选出均在腭裂胚鼠腭部组织中显著差异表达的，且两者间具有碱基结合位点又符合上下游调节属性的circRNA与microRNA。进而构建circRNA-mirocRNA-靶基因的调控网络，并预测差异表达的circRNA的功能。
　　4、对差异表达的circRNAs进行qRT-PCR验证。
　　结果：
　　1、小鼠腭部组织肉眼观察及切片结果：实验组中孕期第14.5天的胚鼠共60只，均出现腭裂，发生率为100%，无死胎及流产胚鼠。对照组中孕期第14.5天的胚鼠共64只，均无腭裂发生。
　　2、两组腭部组织高通量测序分析结果显示差异性表达较大的circRNA共有20个，其中显著差异表达的有6个，其中2个circRNAs下调，4个circRNAs上调。
　　3、在维甲酸诱导的胚鼠腭裂模型中，可能存在有circRNA892－miR693-5p－smad4、circRNA1798－miR302a-3p－Smad2/Fgf10、circRNA2130－micro106a-5p－Tgfbr2/Bmp2/Tmp2三个调控网络参与到腭裂的发生中。
　　4、显著差异表达的circRNAs中circRNA892的PCR扩增表达结果与高通量测序结果一致，且P值小于0.05，有统计学意义。
　　结论:
　　1、与正常胚鼠相比，维甲酸诱导的腭裂胚鼠的腭部组织中出现了circRNA的显著差异表达。
　　2、经qRt-PCR实验验证，circRNA892可能在胚鼠腭裂的形成中发挥了重要作用。