论文部分内容阅读
为深入研究鱼类生长激素和胰岛素样生长因子的生理功能和分子调控机理,该论文以中国重要养殖鱼类鲮为材料,克隆和表达了鲮生长激素和胰岛素样生长因子基因,为深入研究鲤科鱼类生长激素和胰岛素样生长因子的分子调控机理和生理功能打下基础,具体研究内容如下:1、mcIGF-ⅠcDNA的分子克隆和序列分析.根据胰岛素样生长因子Ⅰ基因的保守序列设计合成1对特异引物,采用RT-PCR技术从鲮肝脏总RNA中扩增出鲮胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)基因,将纯化的DNA片段克隆至pUCm-T载体上,构建克隆载体pUCm-mcIGF-Ⅰ.克隆的鲮IGF-ⅠcDNA开放阅读框全长486bp,编码由161个氨基酸残基组成的胰岛素样生长因子Ⅰ多肽.2、mcGHcDNA的分子克隆和序列分析.根据生长激素基因的保守性序列设计合成1对特异引物,利用RT-PCR技术从鲮脑垂体组织中克隆出鲮生长激素成熟肽cDNA片段,将纯化的DNA片段克隆到pUCm-T载体上,构建克隆载体pUCm-mcGH.克隆的鲮GHcDNA开放阅读框全长567bp,编码由188个氨基酸残基组成的生长激素成熟肽.3、mcIGF-ⅠcDNA在大肠杆菌中的表达.根据所克隆的mcIGF-ⅠcDNA序列,设计合成1对引物,以克隆载体pUCm-mcIGF-Ⅰ为模板,扩增鲮mcIGF-Ⅰ成熟肽cDNA(包括B、C、A和D4个区域),定向克隆入大肠杆菌表达载体pQE-30的BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位点,构建表达载体pQE-30mcIGF-Ⅰ,转化大肠杆菌M15(pREP4).工程菌M15(pQE-30mcIGF-Ⅰ)在LB培养基中培养,IPTG诱导表达,收集菌体,SDS-PAGE电泳分析.4、mcGHcDNA在大肠杆菌中的表达.根据所克隆的mcGH cDNA序列,设计合成1对引物,以克隆载体pUCm-mcGH为模板,扩增鲮mcGH成熟肽cDNA,定向克隆入大肠杆菌表达载体pQE-30的BamH I和Hind Ⅲ酶切位点,构建表达载体pQE-30mcGH,转化大肠杆菌M15(pREP4).工程菌M15(pQE-30mcGH)在LB培养基中培养,IPTG诱导表达,收集菌体,SDS-PAGE电泳分析,与对照比较,工程菌在约24.5kDa处有一条特异蛋白带,Western blot印迹分析表明该蛋白带与草鱼GH多克隆抗体具有强烈的免疫反应,说明此蛋白带为表达的重组mcGH.