论文部分内容阅读
辣椒是世界性的蔬菜和加工调味品,为我国第二大蔬菜作物。利用雄性不育系是辣椒杂种优势利用的重要途径,也是当今辣椒育种的主攻方向。雄性不育产生的机理十分复杂,涉及到小孢子发育的一系列结构基因和调节基因。要彻底搞清楚植物雄性不育产生的机制,必须搞清楚小孢子发育过程中的相关基因。从一对等位基因控制的雄性不育两用系入手,是解决这一问题的最佳途径。本研究以辣椒隐性核雄性不育两用系AB114为材料,从形态学、细胞学、分子生物学的角度,对可育株和不育株花蕾的时空表达特征进行研究,取得了如下结果:
⑴可育株与不育株花器官形态及发育动态比较不育株花蕾、花柱、花瓣的大小以及花朵开张度与可育株差别不大,但花药的发育与可育株存在明显差异。在花萼稍裂开,微露花冠时不育株的花药纵、横径明显小于可育株,花药成熟期二者差异达到极显著,表现为不育株花药干瘪、短缩、深紫色,开裂后看不到花粉;而可育株花药饱满、淡紫色,开裂后花粉布满整个花药。
⑵花粉母细胞减数分裂及其雄配子体发育采用染色体压片和爱氏苏木精染色相结合的方法对辣椒可育株与不育株花粉母细胞减数分裂及雄配子体的发育过程进行了观察。结果表明:①花粉的发育进程与心叶以及花蕾的表型特征密切相关。譬如,当花萼稍裂,微露花冠,花柄弯曲时小孢子处于四分体时期;萼冠齐平时90%的小孢子处于单核期;②可育株花粉母细胞减数分裂染色体行为正常,胞质分裂属同时型,四分体以正四面体型和十字交叉型为主,雄配子体只进行1次有丝分裂,成熟花粉为2—细胞型;不育株花粉母细胞减数分裂行为异常,四分体时期彻底败育。
⑶不育株与可育株花药组织切片观察利用石蜡切片技术,在光学显微镜下系统地观察了不育株与可育株花药发育过程的细胞形态学特征,结果表明:败育现象从造孢细胞时期以后的每个阶段都有发生,败育高峰出现在四分体时期;败育的方式主要有坏死型和挤压型;坏死型败育类型主要表现为花粉母细胞和内绒毡层自主凋亡;挤压型败育方式主要表现为绒毡层细胞径向过度伸长、高度液泡化,严重挤压小孢子母细胞,解体较晚且充塞花粉囊室;药室内壁、中层层数增加且延迟消退等。
⑷AFLP体系的建立与优化通过优化AFLP预扩增与选择性扩增步骤的Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶的用量、连接产物稀释倍数、预扩产物稀释倍数以及预变性时间,确立了适用于辣椒AFLP的最佳反应体系:①预扩增体系:连接产物稀释20倍取5μL作模板,混合0.4μM预扩引物,0.04U/μL Taq酶,0.2mM dNTP,2.0mM MgCl2,设置3min预变性时间进行预扩增;②选扩增体系:预扩产物稀释30倍,混合0.6μM选扩引物,其余因素同①。
⑸不育株与可育株蕾期基因表达差异的cDNA—AFLP分析利用cDNA—AFLP技术比较分析了辣椒核雄性不育两用系不育株与可育株蕾期基因表达差异,64对引物组合共检测出306条差异片段,既有质的差异也有量的差异。通过对成功回收并测序的277条差异片段进行序列同源性分析与功能分类,发现约56%的基因功能未知,可能编码新的在花粉和花药发育过程中起作用的蛋白;另外一些TDFs代表的基因涉及细胞壁合成与调控、电子传递和能量途径、转录调控和信号转导、防卫与胁迫反应、普通新陈代谢、蛋白质代谢、转运通道等方面。
⑹育性相关基因的扩增与序列分析基于可育株与不育株花蕾的差别仅表现在花药发育和花粉形成上,在不育株与可育株花蕾中差异表达的基因很可能与花粉花药的发育密切相关。因此,我们从前四个主要的功能类别中分别选择1—2个有代表性的TDF进行RACE扩增。所得序列经同源性搜索发现分别含有a.微管蛋白、细胞色素P450、细胞色素b5、WD40重复蛋白、MYB类转录因子和萌发素类蛋白Cupin—2等超基因家族的保守区域。
⑺代表基因在花蕾不同发育时期的表达特征分析RT-PCR结果表明:来自可育株花蕾的四个代表基因(F—57,F—85,F—65,F—279)的表达量在可育株中随着花蕾的发育均呈现上升趋势,而不育株中却明显受到了抑制;来自不育株花蕾的三个差异表达基因(S—246,S—248,S—262)在不育花蕾的早期或中期提前表达,在对应的可育花蕾中则不表达或低水平表达。这说明在花粉发育的不同时期相关基因的表达或不表达,以及表达水平有序地发生变化都与花粉及其后相关器官正常发育、实现其功能所需相对应,任何基因的突变都有可能导致雄性不育。