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第一部分低蛋白饮食合并α-酮酸治疗肾损伤大鼠后血清对系膜细胞肾素血管紧张素系统表达的影响目的：低蛋白饮食合并α-酮酸是广泛应用于临床慢性肾脏病(CKD)3-4期患者的营养疗法,认为可减少慢性肾脏病患者的尿蛋白,延缓病程进展,但对于其肾脏保护作用的确切机制尚不清楚。本课题组前期工作发现低蛋白饮食合并酮酸可显著减少肾损伤大鼠肾脏局部RAS水平。本研究采用肾损伤大鼠低蛋白饮食合并酮酸治疗后血清干预系膜细胞,旨在观察在排除血流动力学作用的情况下,不同蛋白饮食治疗肾损伤大鼠的血清是否可直接影响肾小球系膜细胞细胞外基质的产生和肾脏局部肾素血管紧张素系统(RAS)的表达。方法：1.动物实验：30只雄性SD大鼠行3/4肾切除术建立中重度肾损伤模型,手术一周后分别给予不同蛋白含量饲料喂养,分组如下：(1)正常蛋白饮食组(Nx-NPD组)：给予18%酪蛋白；(2)低蛋白饮食组(Nx-LPD组)：给予6%酪蛋白；(3)低蛋白饮食合并酮酸组(Nx-LK组)：给予5%酪蛋白+1%α-酮酸,每组10只大鼠。另取10只大鼠行假手术后给予正常蛋白饮食(18%酪蛋白)作为对照组(sham组)。12周后麻醉处死大鼠,收集各组动物血清。2.细胞实验：体外培养系膜细胞,根据干预血清不同分组如下：(1)control组：正常10%胎牛血清干预；(2)sham组：10%sham组动物血清干预；(3)Nx-NPD组：10%Nx-NPD组动物血清干预；(4)Nx-LPD组：10%Nx-LPD组动物血清干预；(5)：Nx-LK组：10% Nx-LK组动物血清干预；(6)sham+LOS组：10%sham组动物血清合并20mmol/l洛沙坦(LOS)干预；(7)Nx-NPD+LOS组：10Nx-NPD组动物血清合并20mmol/l洛沙坦(LOS)干预；(8)Nx-LPD+LOS组：10%Nx-LPD组动物血清合并20mmol/l洛沙坦(LOS)干预(9)Nx-LK+LOS组：10%Nx-LK组动物血清合并20mmol/l洛沙坦(LOS)干预。48小时后收集细胞上清液、蛋白及mRNA。采用ELISA方法检测细胞上清液中AngⅡ、转化生长因子(TGF-β1)、纤连蛋白(FN)及粘连蛋白(LN)的水平。采用Real-time PCR法和免疫印迹法检测系膜细胞AT1受体、FN及TGF-β1的基因和蛋白表达。结果：1.动物实验：各组大鼠体重、血清总蛋白及白蛋白水平无显著差异,肾切除各组大鼠血肌酐水平较sham组明显升高(P值均<0.05),但在肾切除三组间无差异。与sham组相比,Nx-NPD组大鼠尿素氮水平及24小时尿蛋白排泄量显著升高(P值<0.05)。在Nx-LPD组中,血尿素氮及尿蛋白水平较Nx-NPD组显著降低,Nx-LK组降低更明显(P值均<0.05)。2.细胞实验：Nx-NPD组血清干预后细胞分泌AngⅡ水平(Nx-NPD:12.70±0.12; sham:8.04±0.62 ng/ug蛋白)及AT1受体基因(Nx-NPD:0.5752±0.1603; sham:0.2179±0.0763)和蛋白表达水平(Nx-NPD:44.73±1.93;sham:24.61士1.17)均较sham组明显升高,同时伴有FN、LN及TGF-β1基因转录(FN：Nx-NPD:0.2206±0.0203,sham:0.0881±0.0183；LN:Nx-NPD:0.1179±0.0309,sham:0.0686±0.0102；TGF-β1:Nx-NPD:0.0372±0.0079,sham:0.0071±0.0016)和分泌水平(FN:Nx-NPD:39.84±0.06;sham:20.58±0.46 ug/ug蛋白,LN:Nx-NPD:91.31±4.52；sham:66.49±3.90 ug/ug蛋白,TGF-β1：Nx-NPD:83.85±0.56；sham:10.12±1.32 ng/ug蛋白)的上升(P值均<0.05)；Nx-LPD及Nx-LK血清干预组可明显抑制上述改变(P值均<0.05)。应用RAS阻断剂洛沙坦可显著降低Nx-NPD组中FN(LOS(+):mRNA: 0.0416±0.0230；ELISA:20.22±1.63 ug/ug蛋白)及TGF-β1(LOS(+):mRNA: 0.0024±0.0010；ELISA:6.21±0.67 ng/ug蛋白)的合成与分泌，对Nx-LPD组中二者的表达也有进一步抑制作用(P值均<0.05)。在Nx-LK组中,RAS阻断剂仅在基因水平减少了FN及TGF-β1的表达,但对其分泌水平无明显影响。结论：低蛋白饮食合并α-酮酸保证了3/4肾损伤大鼠稳定的营养状态,显著减少24h尿蛋白排泄量。同时,在排除血流动力学影响的情况下,低蛋白饮食合并α-酮酸治疗肾损伤大鼠后血清可直接抑制肾脏局部系膜细胞RAS激活,继而减少FN、LN及TGF-β1的分泌,发挥肾脏保护作用。第二部分不同蛋白饮食治疗肾损伤大鼠后血清蛋白组学检测及生化结果目的：低蛋白饮食合并α-酮酸的营养疗法临床上常用于治疗中重度肾功能损害的慢性肾脏病患者以延缓病程进展。第一部分研究显示低蛋白饮食合并α-酮酸治疗肾损伤大鼠,血清中存在某些物质可直接抑制系膜细胞RAS生成,继而减少ECM及TGF-β1的表达及分泌。本实验通过对不同蛋白饮食治疗的肾损伤大鼠血清蛋白组学检测及生化检测,探查其作用的具体效应因子。方法：30只雄性SD大鼠行3/4肾切除术建立中重度肾损伤模型,手术一周后分别给予不同蛋白含量饲料喂养,分组如下：(1)正常蛋白饮食组(Nx-NPD组)：给予18%酪蛋白；(2)低蛋白饮食组(Nx-LPD组)：给予6%酪蛋白；(3)低蛋白饮食合并酮酸组(Nx-LK组)：给予5%酪蛋白+1%α-酮酸,每组10只大鼠。另取10只大鼠行假手术后给予正常蛋白饮食(18%酪蛋白)作为对照组(sham组)。12周后麻醉处死大鼠,留取血、尿和肾脏组织标本。常规生化检测甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和空腹血糖(FBG)；放免法检测大鼠空腹血清胰岛素。蛋白组学法检测血清中差异蛋白质的表达；比色法测定血清及肾脏组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽髓过氧化物酶(GSH-Px)的水平。应用ELISA方法检测各组大鼠血清中蛋白羰基化水平。结果：1.蛋白组学检测：对4组大鼠328种蛋白质进行蛋白组学检测提示,11%蛋白质即37种蛋白质存在差异。其中15种蛋白质差异存在统计学意义,包括蛋白酪氨酸磷酸酶受体、脂肪酸合成酶、诱导型一氧化氮合成酶、谷胱甘肽髓过氧化物酶前体、粘连蛋白亚单位前体、载脂蛋白E前体、血清白蛋白前体、血清转铁蛋白前体、糖蛋白前体、血红蛋白亚单位、胰岛素样生长因子结合蛋白复合体、胶原α、丝氨酸/精氨酸重复基质蛋白异构体、肝脏羧化酶及纤粘蛋白合成酶,主要参与机体营养代谢、糖脂代谢及氧化应激调节。2.生化检测：(1)大鼠糖脂代谢情况大鼠体重、血清白蛋白及总蛋白水平在各组间无明显差异。空腹血糖水平各组间无显著性差异。但空腹胰岛素水平及胰岛素抵抗指数在手术三组较sham组(insulin:12.48±2.24 um/mL:HOMA-IR:4.51±0.61)显著升高,在Nx-LK组(insulin:18.71±3.92 um/mL:HOMA-IR:10.23±2.02)较Nx-NPD组(insulin:41.86±6.13 um/mL;HOMA-IR:19.93±1.52)及Nx-LPD组(insulin:27.49±4.15 um/mL;HOMA-IR:14.68±0.10)明显降低(P值均<0.05)。同时,LDL.CHO及TG水平在手术三组中较sham组(LDL：0.16±0.03；CHO:1.53±0.11；TG:0.71±0.16 mmol/L)明显增高,Nx-NPD组(LDL：0.33±0.12；CHO:2.89±0.65；TG:1.25±0.46 mmol/L)与Nx-LPD组(LDL0.28±0.10；CHO:2.56±0.51；TG:1.20±0.36 mmol/L)中三者水平无明显差异,Nx-LK明显减轻了CHO及TG(CHO:2.47±0.52；TG:0.92±0.33 mmol/L)的水平。(2)循环氧化应激情况大鼠血清中SOD、MDA及GSH-Px的测定显示相对于sham组,Nx-NPD显著增加了循环氧化应激状态,保护性的SOD(sham：46.51±2.41；Nx-NPD：15.21±1.91 U/ml)及GSH-Px(sham:332.25±33.82;Nx-NPD:63.08±4.85U)显著减少,损伤性MDA(sham:3.20±0.19:Nx-NPD:6.49±0.26 nmol/ml)显著增加,低蛋白饮食有效的缓解了这一改变,低蛋白饮食合并酮酸效果更为显著。于此同时,大鼠血清中蛋白羰基化水平也随着饮食中摄入蛋白的减少而减少。(3)肾脏局部氧化应激情况大鼠肾脏组织匀浆液中SOD、MDA及GSH-Px的测定显示Nx-NPD显著增加了大鼠局部氧化应激状态,表现为相对于sham组,保护性SOD(sham: 152.39±3.78;Nx-NPD:40.82±3.01 U/ml)及GSH-Px(sham:1214.70±21.63; Nx-NPD:589.50±21.25 U)显著减少,损伤性MDA(sham:3.95±0.40; Nx-NPD:11.37±0.74 nmol/ml)显著增加(P值均<0.05)。低蛋白饮食有效的缓解了这一现象。结论：给予肾损伤大鼠低蛋白饮食治疗,可维持大鼠稳定的营养状态,同时有效改善大鼠体内糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗,减轻大鼠全身及肾脏局部氧化应激状态。