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第一部分目的：神经干细胞(neural precursor cells，NSCs)移植作为新型的治疗手段用于神经系统疾病。保证移植入脑内的神经干细胞保持活性，并维持增殖特性以及诱导其定向分化，是移植中的重点。寻找新型药物代替生长因子来维持移植神经干细胞的活性和增殖成为该研究领域的关键问题之一。淫羊藿苷(icarrin，ICA)是补肾中药淫羊藿的主要有效成分。本研究的目的是观察ICA对体外培养的神经干细胞存活和增殖的影响，为今后ICA可能治疗多种神经系统疾病提供实验基础。
方法：(1) NSCs的鉴定：取16—20周自然流产的新鲜人胚胎，机械分离成单细胞悬液，接种到含有生长因子EGF和bFGF的基础培养液中。取培养7d的传代神经球，分别接种到基础培养基和含1％FBS培养液中，分别于12 h时行巢蛋白(nestin)免疫荧光染色，7d时行β—Ⅲ微管蛋白(β—ⅢTubulin/Tuj1)和胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)免疫荧光染色。为进行BrdU标记，培养基中加入含10μM BrdU，2d后行BrdU免疫荧光染色。
(2)观察ICA对NSCs存活和增殖的影响：将机械分离的单个细胞分别接种到96孔板中，24 h后，阳性对照组加入含有EGF(20 ng/ml)和bFGF(10ng/ml)的DMEM/F12基础培养液，ICA用药组加入含有不同剂量ICA(0.1、1、10、20和50μM)的DMEM/F12基础培养液，48 h时加入CCK—8行吸光度测定。细胞接种于24孔板中，加入上述分组培养基，7、14和28 d时用显微镜测微尺测量神经球的直径。取传代生长培养4d的神经球种于铺有多聚赖氨酸的48孔板中，加入上述分组培养基，24 h后加入终浓度为10μM的BrdU，48 h后行免疫荧光染色，计数各组BrdU阳性细胞率。
(3)采用TUNEL免疫荧光染色观察ICA对NSCs凋亡的影响；采用BrdU阳性细胞率观察ICA对另外两种细胞—人胚胎骨髓间充质干细胞(Bone marrow stem cells，MSC)和人胚胎皮肤成纤维细胞(Human skin fibroblast，HSF)的增殖作用；进一步阐明ICA对NSCs增殖作用的特异性。
结果：(1)贴壁正常培养12 h，免疫细胞荧光染色显示神经球中的细胞几乎均为nestin阳性，诱导分化7d时，神经球可分化为β—Ⅲ Tubulin和GFAP阳性的细胞；BrdU标记显示神经球中绝大部分细胞的细胞核为BrdU阳性。结果证实我们培养的细胞是NSCs，可以用来进行进一步的药物研究。
(2) ICA和细胞共孵育48 h，药物浓度在0.1～20μM范围内，细胞生长良好，OD值无明显降低；且在10、20μM时OD值与对照组相比有明显增高(P<0.05)；在50μM时，OD值有明显下降(P<0.05)。结果表明，ICA在10-20μM范围内有促进神经干细胞(NSCs)存活的作用。
(3)培养7d时，空白对照组细胞绝大部分贴壁生长；而ICA10和20μM组(不含生长因子)有较多神经球生成；培养至28 d时，ICA处理组的神经球体积明显增大。统计结果显示，与无生长因子对照组相比，10和20μM ICA组神经球的直径显著增加(P<0.01)。
(4)加入BrdU48 h，各组均有细胞被BrdU标记。统计结果显示：与空白对照组相比，ICA10和20μM组BrdU阳性细胞率有明显增加，说明这两个剂量有促进NSCs增殖的作用。
(5) TUNEL染色结果显示，各组均有少量阳性细胞，多数集中在神经球内部，经统计，空白对照组、阳性对照组和10μM ICA组细胞凋亡率均较小，且没有明显差异，说明ICA对NSCs的凋亡没有影响，也说明ICA不是通过减少凋亡来促进NSCs增殖的。
(6)在骨髓间充质干细胞(MSC)和人皮肤成纤维细胞(HSF)培养中，ICA的无毒范围是0.1～20μM。加入BrdU48小时后，10-20μM ICA处理组的BrdU阳性细胞数与对照组相比无明显增多，表明ICA没有促进MSC和HSF增殖的作用。
结论：我们成功分离、培养、鉴定了人胚胎纹状体NSCs，且ICA可以促进体外培养的NSCs的存活和增殖，并进一步证明，这种增殖作用具有特异性。
第二部分目的：在我们第一部分研究中已发现淫羊藿苷(ICA)能促进NSCs的增殖。本研究的目的是继续深入了解ICA促进NSCs增殖的作用机制，尤其是对FGF受体和Wnt信号通路的影响。
方法：NSCs的培养方法与我们第一部分的研究相同。ICA与NSCs孵育7天(无EGF和bFGF)，收集提取细胞的总RNA，应用凝胶电泳检测RNA有无降解。应用人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片(22000个基因)技术，以荧光染料cy5(红色)标记探针检测ICA处理细胞的mRNA，cy3(绿色)标记探针检测空白对照组的mRNA，比较两组之间的基因表达差异。采用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)技术检测FGF受体1(FGFR1)和Wnt信号通路重要因子FZD7、DVL3、CTNNB1和GSK3B的mRNA表达。
结果：(1)人类全基因组表达谱芯片结果显示，ICA10μM与对照组相比，基因表达上调的有332个，下调的有447个。经MAS分析系统可得，有30条信号通路在药物作用机制中发挥重要作用，结合神经干细胞特有的增殖通路，发现ICA可能通过FGF信号通路和Wnt信号通路发挥增殖作用。
(2) Real-Time PCR结果显示，ICA能上调FGF受体1—mRNA的表达(P<0.01)，提示FGF信号通路作用增强。另外，ICA上调FZD7—mRNA(P<0.01)、DVL3—mRNA(P<0.05)和CTNNB1—mRNA的表达，下调GSK3B—mRNA(P<0.01)的表达，这些变化提示Wnt信号通路作用增强。
结论：ICA可能通过增强FGF信号通路和Wnt信号通路发挥促进神经干细胞增殖的作用。