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目的:
研究啤酒酵母的线粒体DNA在重离子辐照作用下的突变效应及其突变机理。
材料与方法:
利用兰州重离子研究装置(HIRFL)加速的氖、碳离子辐照酵母细胞,用TTC显色培养基筛选呼吸缺陷型酵母菌株,并用mtDNA限制性酶切手段分析其突变规律。采用PCR扩增并对目的产物测序的方法对辐照后线粒体DNA上的I类内含子和II类内含子进行研究。
结果:
1.TTC显色实验表明:离子束辐照导致酵母线粒体上的电子传递链发生改变,产生的还原氢减少,造成呼吸缺陷。
2.利用限制性酶切实验对线粒体DNA进行研究,结果表明:离子束辐照诱变筛选出来的呼吸缺 陷型酵母菌株其线粒体DNA变化明显:主要表现为酶切条带缺失严重。即使在同一注量下筛选出来的呼吸缺陷型酵母菌株,其酶切图谱也不相同。
3.通过PCR手段对辐照后酵母线粒体DNA碱基序列进一步进行分析,发现经不同注量离子束辐照 后筛选出来的呼吸缺陷型酵母菌株,其I类内含子(ai4 and ai5)经设计不同引物进行扩增,没有获得目的条带,说明此序列发生了突变,可能对离子束辐照比较敏感。
4.经不同注量离子束辐照后筛选出来的呼吸缺陷型酵母菌株,其II类内含子(ai2)的碱基序列与野生型相比没有变化,表现出在离子束辐照作用下比较稳定的特性。
5.在不同注量离子束辐照后筛选出来的呼吸缺陷型酵母菌株中扩增获得位于第12染色体上的SOFI基因,而在同样的扩增体系中没有得到野生型菌株的该基因。
6.选取离子束辐照后筛选出来的呼吸缺陷型酵母菌株再次进行辐照,发现其在低剂量范围(<0.93Gy)辐照下非常敏感,而在高剂量范围(>0.93Gy)又表现出一定程度的辐射抗性。
结论:
1.离子束辐照酵母细胞,直接或间接作用于酵母线粒体DNA,导致线粒体DNA损伤,形成呼吸缺陷的酵母菌株。
2.I类内含子和II类内含子对于离子束辐照的敏感性不同:II类内含子比较稳定,II类内含子可能利用自身编码的反转录酶通过日的DNA引导的反转录机制对受到辐照损伤的II类内含子进行修复。
3.离子束辐照后SOF1基因可能发生了突变,影响酵母细胞的生长。
4.呼吸缺陷型酵母菌株冈其线粒体DNA发生变化及线粒体功能的改变,使呼吸缺陷型酵母菌株在不同剂量区的离子束辐照下表现不同辐射敏感性。