论文部分内容阅读
本文通过以下几个部分展开论述： 第一章 番茄花粉受体激酶LePRK1信号复合体的解析 背景:花粉管的极性管状生长对于显花植物有性生殖中双受精过程的顺利完成至关重要。番茄花粉受体激酶LePRK1是一个花粉特异表达且定位于花粉管细胞膜上的类受体激酶(RLK)。之前的研究表明，LePRK1能够和另外一个番茄花粉受体激酶LePRK2以及一个RopGEF蛋白——KPP(Kinase Partner Protein，激酶伴侣蛋白)相互作用。但LePRK1在番茄花粉管体内的生物学功能及其作用机制一直是未知的。 方法与结果:实验室已有的工作发现，通过使用基因枪技术在烟草花粉管中瞬时过表达LePRK1后，花粉管顶端膨大并且产生连续生长的小泡，亦即花粉管从管状极性生长模式转变为泡状生长模式。瞬时过表达缺失胞外结构域的LePRK1(LePRK1ΔECD)的花粉管也具有相同的表型。同时，在拟南芥花粉管中稳定过表达缺失胞外结构域的LePRK1(LePRK1ΔECD)时花粉管也具有类似的表型。过表达LePRK1会导致花粉管中肌动蛋白纤丝(F-actin)的不正常分布。在之前的酵母双杂筛库的研究结果中，我们发现了一个能够和KPP相互作用的肌动蛋白成束蛋白(F-actin bundling protein) PLIM2a。通过体外的pull down实验，我们发现PLIM2a能够和KPP以一种Ca2+依赖的形式相互作用。酵母双杂交实验也确认了这种相互作用。PLIM2a是一个不依赖Ca+离子浓度的肌动蛋白成束蛋白，但在高Ca2+离子浓度的条件下，KPP能够促进PLIM2a对肌动蛋白纤丝的成束作用。以前的实验结果发现，在烟草花粉管中同时过表达LePRK1和PLIM2a时，PLIM2a能够抑制LePRK1单独过表达时的表型，而同时过表达LePRK1，PLIM2a和KPP时，花粉管恢复了LePRK1单独过表达时的表型。 结论:基于上述研究结果，推断，在花粉管中瞬时过表达LePRK1后，LePRK1通过KPP-PLIM2a调控花粉管肌动蛋白骨架的变化，从而实现了花粉管从管状生长模式到泡状生长模式的转变。这项研究揭示了花粉管细胞的一种潜在的能力，即通过单独过表达一个膜定位的分子LePRK1或LePRK1ΔECD，花粉管可以切换到另一种生长模式（即从管状生长模式转变为泡状生长模式）从而实现花粉管生长前缘(leading edge)的进一步延展。这一生长模式类似于已经报道的盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)和果蝇干细胞的泡状生长模式。 第二章 番茄成熟花粉与萌发3h后花粉管转录组的研究 背景:番茄是一种重要的经济作物，同时番茄也是植物果实发育特别是浆果发育的重要模式植物。番茄果实的发育从双受精正常完成后开始，而花粉的萌发以及花粉管在番茄柱头和花柱的正常生长对于双受精的正常完成至关重要。解析成熟花粉和萌发后花粉管转录组的差异对于深入研究花粉管的生长机制极有帮助。已有的植物成熟花粉和花粉管转录组数据是基于基因芯片的数据，无法准确比较同一组织中不同基因表达量的高低。尽管拟南芥和番茄已有利用RNA-seq研究成熟花粉转录组的报道，但是利用RNA-seq技术分析植物花粉管转录组的研究目前仍没有被报道。 方法与结果:为了研究番茄成熟花粉在萌发后的转录组变化，利用RNA-seq技术对番茄栽培种VF36的成熟花粉和在体外萌发3h后的花粉管进行了测序。显微染色实验表明，成熟花粉经体外萌发3h后形成的花粉管全部具有胼胝质塞，表明3h的时间点设置是合适的。对传统的过滤方法改良并做对照实验后发现，改良过滤法能够过滤掉花粉管样品中绝大多数未萌发的花粉粒。花粉和花粉管样品经pair-end测序后得到的大部分reads可以映射到番茄栽培种Heinz1706的基因组上。差异基因分析最终得到997个差异表达的基因。此外7258个基因表达在番茄的成熟花粉中，7197个基因表达在体外萌发3h后的花粉管中。GO分析和mapman分析表明番茄花粉和花粉管的转录组较为相似，差异表达的基因主要集中在细胞壁和脂类代谢等生理过程中。此外几类类受体激酶(RLKs)和热激蛋白(Hsps)在花粉和花粉管中高表达。另外结合其他物种的转录组数据分析后表明，植物花粉中淀粉生物合成相关基因的表达模式同花粉发育过程中淀粉的变化模式一致。利用IGB，部分不完全注释的UTRs和错误注释的基因也被鉴定出来，暗示着番茄成熟花粉和花粉管中的基因需要进一步的注释。 结论:利用RNA-seq技术分析番茄成熟花粉和花粉管的转录组差异，可以在同一组织（花粉或花粉管）中准确比较不同基因的表达量高低，克服了基因芯片在这方面的不足，从而为继续深入研究相关基因在花粉发育和花粉管生长过程中的作用提供重要依据。