论文部分内容阅读
放线菌是一类具有重要经济学价值和生物学意义的原核生物。近年来,药用植物内生菌被作为重要的药物来源而日益得到重视。从三种药用植物番荔枝、喜树和红豆杉中共分离到150株内生放线菌,生物活性测定结果显示,72.4%的菌株具有至少能拮抗一种指示菌的能力,且其中9.3%的菌株具有细胞毒活性,10.7%的菌株具有抗氧化活性。对这些菌株进行一些次级代谢产物的生物合成基因筛选,发现编码3-氨基-5-羟基合成酶(AHBA),聚酮合成酶(KS),细胞色素P450羟化酶(CYPs)和环氧酶(ES)基因的阳性率分别达到4.7%,12.7%,2.7%和11.3%。根据传统的形态学、化学鉴定方法及现代分子生物学技术进行菌种鉴定,结果显示这三种药用植物中分离到的内生放线菌绝大多数是链霉菌,只有2株来源于红豆杉根部组织的内生菌为拟无枝菌酸菌。这些研究结果表明,药用植物内生放线菌是先导药物的重要潜在资源。
在对药用植物内生放线菌资源进行挖掘过程中,得到一系列AHBA合成酶基因阳性菌株,我们选择了编号为A00122的喜树内生放线菌建立基因组文库并从中得到了部分可能的安莎类化合物生物合成基因簇。在A00122的发酵产物中还分离到一个已知的Ⅲ型PKS化合物germicidin,利用异源引物对基因文库进行筛选后,得到了编码germicidin的完整生物合成基因。
链霉菌Streptomyces.CS是一株来源于滇南美登木愈伤组织的内生放线菌,从它的发酵产物中分离到多种组分的安莎类抗生素naphthomycins。通过建立基因组DNA文库,利用AHBA合成酶基因作为探针对文库进行筛选,对3个连续的fosmid进行测序,共得到106 kb的连续序列。大片段缺失的结果说明该序列与naphthomycins的合成相关。这个生物合成基因簇共有32个开放阅读框,包含了所有naphthomycins合成所需的结构基因和后修饰基因,及一些与转录调控和运输相关的基因。对其中的nat1基因进行生物信息学分析,发现它属于FADH2依赖型氯代酶编码基因。进一步对该基因进行突变,确定其编码的Nat1负责naphomycin含氯组分中C19位上的氯代反应。将nat1和ansamitocins中负责氯代的asm12基因分别对nat1突变株和asm12突变株进行体内交互回补实验,结果显示这两个基因可以互相回补,使突变株恢复产生相应氯代产物的功能。对生物合成基因簇中的另一个预测与萘环形成相关的基因nat2进行突变后,产物中检测不到任何naphthomycins组分,证明其是naphthomycins合成过程中的关键酶之一。
在推测的苯安莎类抗肿瘤化合物ansamitocins的PKS后修饰过程中,最后一步反应分别由Asm10和Asm25完成,它们利用相同的底物N-去甲基-ansamitocins(PNDs),分别催化酰胺N上的甲基化或糖基化反应。生物信息学分析结果显示,Asm10是一种SAM依赖型甲基转移酶,属于亮氨酸羧基甲基转移酶(LCM)亚家族。体内基因失活及回补实验和体外催化反应的结果都说明Asm10负责的是从PNDs到APs的N-甲基化反应。体外表达的Asm10在天然状态下以单体形式存在,大小约为33 kDa,反应最适温度为32℃,最适pH为10.0,且在pH继续升高的情况下仍保持着良好的催化活性。选用rifamycinSV、geldanamycin和两个小分子化合物作为底物检测Asm10的催化特异性,发现Asm10均能催化这些分子的甲基化反应,但活性很低。对Asm10中预测的两个可能的SAM结合位点Asp154与Leu155进行定点突变,结果使蛋白催化活性大大下降甚至丧失,证实这两个氨基酸是维持Asm10活性的重要氨基酸。