鱼类kisspeptin与gnih信号系统的鉴定及其在生殖调控中的作用研究

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神经内分泌因子,Kisspeptin与GnIH(gonadotropin-inhibitory hormone)对哺乳动物的生殖轴起着直接而相反的调控作用,Kisspeptin通过刺激下丘脑GnRH的分泌,从而促进脑垂体GtH的合成与释放,而GnIH则直接或通过GnRH抑制GtH的合成与释放。本文利用比较基因组学技术,结合分子生物学手段,在斑马鱼(Danio rerio)、金鱼(Carassius auratus)中鉴定了kisspeptin/gpr54与gnih/gnihr信号系统,研究了它们在青春期启动、GtH分泌、性类固醇激素反馈调控方面的作用,并检测kisspeptin及其类似物对鱼类催产的效果。主要研究结果如下:   ⑴与哺乳类不同,在鱼类中存在2种kisspeptin(kiss1、kiss2)与2种gpr54(gpr54a、gpr54b)基因。通过基因共线性分析:鱼类的2种kiss来源于一个共同的祖先基因,在脊椎动物发生早期,通过基因组或者染色体片段的复制而形成,经过漫长的生物进化,在高等哺乳动物中已经丢失了kiss2基因,而在鱼类仍然保留着两个kisspeptin基因。为了进一步研究它们的功能,我们在金鱼中克隆了kiss1、kiss2以及它们的受体gpr54a、gpr54b基因的cDNA全长序列。组织分布显示:kiss1、kiss2、gpr54a、gpr54b在金鱼生殖相关组织或区域(下丘脑、垂体、性腺)均有丰富的表达,提示kisspeptins可能参与鱼类的生殖调控。通过配体受体结合实验,证实了两种kisspeptins均能结合gpr54s(gpr54a、gpr54b),启动下游信号通路,但存在一定的配体-受体选择性差异。   ⑵通过同源比对搜索,在硬骨鱼类的基因组数据库中发现了GnIH的同源基因。同线性分析表明,gnih基因在鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类都维持着保守的同线性结构;根据预测出来的序列,我们在斑马鱼中克隆了gnih基因以及三个潜在的gnih受体基因(gnihr1、gnihr2、gnihr3)的cDNA序列全长。同源比对结果显示:GnIH的氨基酸序列在不同物种中存在较大的差异。GnIH受体的序列同源比对和进化树分析都表明斑马鱼三个gnihrs属于gnih的受体。组织表达模式研究显示:gnih与gnihrs主要在斑马鱼脑中表达,提示它们的作用区域主要在脑区。此外,我们还研究了gnih与gnihrs在斑马鱼胚胎发育过程的表达变化。gnih的表达在5-原基期首次被检测到,之后一直维持在相对恒定的水平;而三个gnihrs在整个胚胎和早期发育过程都有表达。   ⑶运用realtime-PCR方法,我们检测了kisses、gpr54s、gnih与gnihrs在斑马鱼青春期发育过程中的表达变化。两个kiss基因在青春期启动前表达开始上升,但它们的表达模式又有所不同;而两个gpr54s的表达模式呈现互补的趋势;提示它们在青春期发育的过程中可能具有不同的功能。gnih与gnihr1的表达在斑马鱼青春期发育过程中没有显著变化,而gnihr2、gnihr3在卵黄生成中期显著升高,其中的分子机制目前还不是很了解。   ⑷通过化学合成金鱼kisspeptins与斑马鱼gnih的核心肽,在体注射成熟的雌性金鱼,发现kiss1能显著刺激金鱼LH的分泌,而kiss2不能;在较高剂量,gnih亦能有效地抑制金鱼LH的分泌。然而,在离体实验中,2种kisspeptin与gnih对金鱼垂体细胞LH的分泌均没有显著的影响,提示kisspeptins与gnih对金鱼的LH调控可能发生在下丘脑水平。   ⑸通过切除金鱼的卵巢,运用realtime-PCR检测下丘脑kiss1、kiss2与gnih的表达。研究发现:卵巢切除后下丘脑kiss1基因的表达没有显著性的变化;kiss2的表达则升高了,在雌激素补偿后有所降低;gnih在卵巢切除后,表达量下降,在雌激素补偿后,恢复到对照组的水平。提示性类固醇激素对金鱼下丘脑的kiss2具有负反馈调控作用,对gnih具有正反馈调控作用。   ⑹用kisspeptin和kisspeptin类似物对金鱼、鲫鱼、泥鳅进行催产检测,发现它们具有一定的催产效果,但是催产率不高。
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