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胃肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内发病率和死亡率均居前列。尽管近年以来，随着早期诊断、手术技术、辅助治疗及靶向治疗的发展，对于胃肠癌患者的生存有一定的改善，但是远期预后效果仍不能让人满意。因此，探寻胃肠癌发生发展的分子机制，寻找作为早期诊断依据和靶向治疗的位点，提高早诊率及患者生存时间对于临床医生显得极为迫切。 基因组测序工程显示人类基因组包括约20000种蛋白编码基因，仅占总基因的约2％，超过90％的转录子是非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）。NcRNA中的microRNA（miRNA）在过去几年中受到了广泛的关注和研究。长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)，是一种长度大于200个核苷酸，广泛存在于真核细胞的细胞核和细胞质中，但却不能编码蛋白质的RNA。通常由RNA聚合酶Ⅱ转录而成，不存在有开放阅读框，具有明显的时空表达特异性。根据它们在基因组上相对于蛋白编码基因的位置和特征的不同，可将lncRNA分为五大类:(1)正义lncRNA（sense-lncRNA）;(2)反义lncRNA（antisense-lncRNA）:(3)双向lncRNA(bidirectional lncRNA);(4)基因内lncRNA(intronic lncRNA);(5)基因间lncRNA（intergenic lncRNA），即lincRNA。LncRNA参与了许多真核细胞的生物活动，它可以在表观遗传学、转录及转录后水平调节基因表达，在人类的生长发育以及细胞凋亡分化等诸多方面有重要作用。在过去的几年里，越来越多的证据表明，lncRNA可能和多种疾病的发生发展相关。在这些与肿瘤相关的lncRNA中，同源基因相关的lncRNA例如HOTAIR以及HOTTIP已经被认为具有重要的生物学意义，其与多种疾病的发生发展密切相关。HOTAIR，编码2.2kb lncRNA分子，包括6个外显子。有研究者报道HOTAIR在包括乳腺癌、结直肠癌等在内的多种肿瘤中表达上调且与不良预后相关，可能充当着原癌基因的作用。关于HOTTIP，它定位于染色体7p15.2上，有研究者发现HOTTIP可与WDR5/MLL复合物结合，并进一步促进H3K4的甲基化以及末端HOXA基因的转录激活，而且HOTTIP在皮肤癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌及结直肠癌等癌症中异常表达，且与预后相关。 在本项研究开始前，HOTTIP在胃癌中的研究仍是空白。另一方面，本研究基于芯片分析结果，发现一个新型的lncRNA RUNX1-IT1在肠癌中表达异常。而目前对于lncRNA在胃肠癌中的作用以及与诊断价值方面的报道相对较少，仍具有较广泛的研究价值。本研究主要检测lncRNA HOTTIP、RUNX1-IT1在胃肠癌中的表达情况，并研究它们与胃肠癌诊断、临床病理资料以及预后的关系，探索它们在胃肠癌中的临床价值。同时，我们试图阐明RUNX1-IT1对于结直肠癌细胞表型的影响及机制，为结直肠癌的治疗提供理论依据及新靶点。 材料与方法: 一、临床标本收集 临床标本均来源于中国医科大学附属第一医院胃肠肿瘤外科在2009-2010年间做手术的患者，所有患者均接受胃癌或者结直肠癌根治术，每例手术标本包括癌组织及配对的远离癌灶至少5cm以上的非癌组织。所有患者术前均未接受任何形式的放疗或者化疗。 二、细胞购买及培养 胃癌细胞系MGC-803、BGC-823、SGC-7901和HGC-27来源于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，结直肠癌细胞系RKO、HCT116、HT-29、SW620、SW480以及人正常结直肠粘膜细胞FHC均购于美国模式培养物集存库(Americantype culture collection，ATCC)。所有细胞培养于37℃，5％ CO2及饱和湿度的温箱中。 三、RNA提取、反转录及实时定量PCR 癌组织、配对癌旁组织及细胞的RNA均用TRIzol试剂提取，使用微量分光光度计测RNA浓度及纯度，检测结果A260/A280值在1.9-2.0之间表示RNA纯度较高。然后使用Takara反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录，使用Takara荧光染料在LightCycler(@)480Ⅱ Real-time PCR仪上进行实时定量PCR反应。采用2-△△CT法分析数据结果。 四、慢病毒载体及稳定表达细胞系构建 我们根据芯片提供的RUNX1-IT1的序列，送上海吉玛基因公司合成目的基因，并利用高表达载体构建。我们根据在各个肠癌细胞系中表达高低的情况，选择HCT116为我们转染的靶细胞。细胞经过病毒转染、传代，在显微镜下观察其荧光表达，并提取细胞RNA，反转RNA及实时定量PCR检测其转染效率。经多次传代后荧光持续表达及转染效率持续升高，即稳定表达细胞建成。 五、迁移实验及细胞增殖实验 细胞迁移实验使用Transwell小室检测，每组实验至少进行3次重复。 细胞增殖实验采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂检测，在接种后0h、24h、48h、72h、96h取出细胞加入10 uL CCK-8试剂进行450nm波长处的吸光度检测。根据吸光度值描绘细胞增殖曲线，每组实验至少进行3次重复。 六、细胞周期及细胞凋亡检测实验 细胞周期检测实验采用南京凯基生物的细胞周期检测试剂盒进行。消化收集细胞后，加入70％的预冷乙醇固定然后使用PI染料染色，4℃避光反应后，上流式细胞仪检测。 细胞凋亡检测实验使用凯基AnnexinⅤ-EGFP细胞凋亡检测试剂盒进行，消化收集细胞后，加入Bingding Buffer固定，然后加入AnnexinⅤ-APC及PI染料染色，最后上流式细胞仪检测。 七、数据分析 运用Wilcoxon符号秩检验对癌组织及癌旁组织的lncRNA的表达水平进行比较。采用非参数检验方法分析lncRNAs表达水平与胃肠癌患者临床病理资料的关系。运用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)对lncRNAs的胃肠癌诊断能力进行综合统计和判断。生存分析采用Kaplan-Meier法计算生存率，并采用log-rank检验对高表达及低表达组差异进行评估。采用Cox比例风险模型进行单因素分析和多因素分析。 所有数据统计运用SPSS22.0统计软件进行分析，P＜0.05被认为有统计学差异。 结果: 一、LncRNA HOTTIP、RUNX1-IT1在胃肠癌组织中的表达 我们利用实时定量PCR的方法检测发现，在94例胃癌患者中，lncRNA HOTTIP在胃癌组织中较癌旁组织，表达显著降低(P＜0.01)。在96例结直肠癌患者中与癌旁组织相比，lncRNA RUNX1-IT1在结直肠癌组织的表达水平显著下调(P＜0.01)。 二、LncRNA HOTTIP、RUNX1-IT1与胃肠癌患者临床病理资料的关系 我们非参数检验方法检测lncRNAs表达水平与胃肠癌患者临床病理资料的相关性，结果发现这两lncRNAs的相对表达水平与胃肠癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、组织分化程度、TNM分期等因素无显著相关性。 三、LncRNA HOTTIP、RUNX1-IT1与胃肠癌患者预后的关系 我们应用了Kaplan-Meier法评估了lncRNAs的表达水平和胃肠癌患者预后之间的关系。结果提示HOTTIP高表达组及HOTTIP低表达组这两组胃癌患者的总生存率无统计学差异。同时发现RUNX1-IT1高表达组及RUNX1-IT1低表达组这两组结直肠患者的总生存率以及癌症特异生存率均无显著差异。 四、LncRNA HOTTIP、RUNX1-IT1对于胃肠癌诊断的意义 应用ROC曲线对lncRNAs的胃肠癌诊断能力进行综合统计和判断。我们发现在胃癌，HOTTIP的曲线下面积(AUC)为0.767;在结直肠癌，RUNX1-IT1的AUC为0.780。说明这两lncRNA在胃肠癌中有较好的诊断能力，可能是胃肠癌潜在的分子标志物。 五、细胞迁移实验及细胞增殖实验结果 迁移实验结果显示，相同条件下与对照细胞Lv-NC相比，Lv-RUNX1-IT1细胞的迁移能力明显减弱。而细胞增殖实验结果提示:相同条件下在96h发现，与对照细胞Lv-NC相比，Lv-RUNX1-IT1细胞的增殖能力明显降低。 六、细胞周期及细胞凋亡检测实验结果 细胞周期检测实验结果显示:Lv-RUNX1-IT1细胞与对照细胞Lv-NC在细胞周期各期之间比例并无明显差异。细胞凋亡检测实验则提示:Lv-RUNX1-IT1细胞和对照细胞Lv-NC两组之间凋亡细胞比例无显著差异。 结论:1、与配对的癌旁组织相比，lncRNA HOTTIP在胃癌组织中的表达水平显著降低，lncRNA RUNX1-IT1在结直肠癌组织中表达明显下调;2、HOTTIP可能作为胃癌的分子标志物;3、RUNX1-IT1可能作为肠癌的分子标志物;4、细胞功能实验证实，RUNX1-IT1可抑制肠癌细胞迁移及增殖能力，但不能影响肠癌细胞的周期及凋亡。