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以分离自患病红笛鲷的溶藻弧菌HY9901为研究对象,参照GenBank上登录的其他弧菌鞭毛蛋白基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的3个鞭毛蛋白基因(flaA、flaB和flaC)。flaA基因含有一个1131 bp的开放读码框(ORF),编码由376个氨基酸组成的鞭毛蛋白FlaA,预测分子量约为39.8 kDa,PI为4.59；flaB基因含有1134 bp的开放读码框,编码由377个氨基酸组成的鞭毛蛋白FlaB,预测分子量约为40.1 kDa,PI为4.76；flac基因含有1155 bp的开放读码框,编码由384个氨基酸组成的鞭毛蛋白FlaC,预测分子量约为40.8 kDa,PI为4.41。与其它几种弧菌相比,氨基酸序列的同源性高于核苷酸序列同源性。
将上述鞭毛蛋白基因分别亚克隆到原核表达载体pET-32a(+),构建原核表达质粒pET-flaA、pET-FIaB和pET-flaC,且在大肠杆菌BL21(DE3)中获得大量表达。优化表达条件,用纯化后的重组蛋白免疫SPF级小鼠,制备了多克隆抗体。Western blot结果显示,各重组蛋白具有免疫反应性,鼠抗FlaA、FlaB和FlaC多抗不仅和各自的重组蛋白抗原反应,而且能够与溶藻弧菌的全菌蛋白产生免疫印迹。免疫电镜证实胶体金颗粒位于弧菌的鞭毛上,表明表达的鞭毛蛋白就是溶藻弧菌的鞭毛蛋白成分。
应用重叠延伸剪切技术,将flaA和flaB二个基因,经三次PCR获得融合基因片段flaA-flaB,定向插入原核表达载体pET-32a(+)中,成功构建了融合基因原核表达质粒pET-flaA-flaB,且在大肠杆菌中获得表达。Western blot结果表明鼠抗FlaA、FlaB重组蛋白血清均能与融合蛋白FlaA-FlaB发生免疫反应,免疫条带和预期的带His-Tag的融合蛋白大小一致。
将表达的FlaA、FlaB、FlaC、FlaA-FlaB及混合蛋白FABC(FlaA、FlaB、FlaC)和全菌灭活苗(FKC)分别免疫红笛鲷,ELISA检测抗体效价结果表明,所有免疫组鱼都可检测到抗体,免疫组的抗体效价和非免疫对照组的差异显著(P<0.01),且在第4周各重组蛋白免疫组鱼抗体水平达到峰值,FABC抗体水平最高,FlaA-FlaB产生的抗体水平和FKC基本相当。在单个重组蛋白免疫组中,FlaA诱导产生的抗体水平较高,其次是FlaC,再其次是FlaB。在攻毒试验中,以FABC和FlaA-FlaB的免疫保护率最高(88％),其次为FlaC和FKC(84％),FlaA和FlaB组为80％。因此,认为溶藻弧菌鞭毛蛋白基因的表达产物FlaA、FlaB、FlaC可作为基因工程亚单位疫苗的候选蛋白。
将溶藻弧菌鞭毛蛋白flaA基因作为抗原基因,成功构建真核表达质粒pcDNA-flaA,将该质粒肌肉注射红笛鲷。采用PCR和RT-PCR,检测该真核表达质粒在红笛鲷组织内的分布、表达。PCR结果显示:免疫接种7 d和28 d,注射点周围肌肉、鳃、肾脏、肝脏和脾脏都存在质粒分布；RT-PCR检测结果显示:免疫接种后第7 d和第28 d,红笛鲷不同组织内均有目的基因表达。ELISA结果表明:鱼血清内存在抗FlaA的抗体,表明DNA疫苗免疫后鱼体表达了目的蛋白,并诱导产生了相应抗体。在攻毒试验中,重组质粒免疫保护率达88％,表明对红笛鲷的保护作用很强。