【摘 要】
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Zika virus(ZIKV)是一种虫媒传播病毒,与登革病毒、黄热病毒和西尼罗病毒等都是一个单股正链的RNA病毒,属于黄病毒属,黄病毒科。自1947年4月从发热的哨兵恒河猴的血清中分离
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Zika virus(ZIKV)是一种虫媒传播病毒,与登革病毒、黄热病毒和西尼罗病毒等都是一个单股正链的RNA病毒,属于黄病毒属,黄病毒科。自1947年4月从发热的哨兵恒河猴的血清中分离后,已经在很多国家和地区引起疫情并且流行开来,与严重的临床表现和先天性畸形有关。但是,目前还没有有效的抗病毒药物和疫苗可以用于ZIKV的临床治疗,因此对于安全有效的ZIKV抗病毒药物和疫苗的研究刻不容缓。复制子系统已经被证明是一个有效的药物筛选工具。在本文中,我们主要开展了以下三个方面的工作:稳定表达海肾荧光素酶(Rluc)的ZIKV复制子的构建;复制子用于抗病毒药物筛选实验;ZIKV复制子反式包装系统的构建。一、稳定表达海肾荧光素酶(Rluc)的ZIKV复制子的构建在本文中,我们在ZIKV感染性克隆的cDNA基础上构建了一个ZIKV复制子(Rluc-ZIKV-Rep)。在这个复制子中,引入了一个表达海肾荧光素酶的报告基因Renilla luciferase,复制子在细胞中的表达和复制可以通过细胞中的海肾荧光素酶活性和RT-PCR检测到。二、复制子用于抗病毒药物筛选实验在抗病毒药物筛选研究中,我们使用了一些小分子药物,特别是马尼地平和西尼地平。随着这些药物浓度的增加,Rluc-ZIKV-Rep在细胞内的复制呈现剂量依赖的抑制效应。证明我们构建的ZIKV复制子是一个有效的抗病毒药物筛选的工具。三、ZIKV复制子反式包装系统的构建在本文中,运用反向遗传学的方法构建ZIKV复制子的反式包装系统,通过PCR的方法从ZIKV感染性克隆的cDNA上扩增出ZIKV的结构蛋白基因,构建了一个含ZIKV结构蛋白的真核表达载体——CprME-pcDNA3.1,并通过Western Blot鉴定了其在两种不同细胞(293T和Vero)中的表达。为了制备复制子包装颗粒,我们将复制子和表达结构蛋白的质粒通过共转染和顺次转染的方法转入细胞,使结构蛋白基因和非结构蛋白基因共表达于细胞中。然后,收集细胞上清,继续感染Vero细胞,通过检测细胞中的荧光素酶活性,定量复制子包装出的缺陷型病毒的产量。在此基础上,我们可以通过293T细胞制备出缺陷型的病毒样颗粒,为ZIKV新型疫苗的研究奠定基础。
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