论文部分内容阅读
昆虫在长期的进化过程中，逐渐形成了一套完整的化学感受系统，在这个感受系统中，化学感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）起到非常重要的作用。中华蜜蜂Apis cerana cerana（简称中蜂）作为我国的本土蜜蜂，具有抗寒、抗逆、适应性强、出勤时间长、能利用零星蜜源等特点，在传粉授粉方面具有更优越的作用，并且中蜂具有抗螨、病虫害发生较少和嗅觉敏锐等优点，这均是西方蜜蜂Apis mellifera L.所不能及的。为此，本文成功克隆了中华蜜蜂化学感受蛋白基因家族全部6条基因序列，并对其序列进行了分析，进而利用分子生物学手段对中蜂CSPs进行研究，为CSPs的生物学功能研究提供参考。1、利用RT-PCR技术扩增、克隆获得中蜂CSPs基因家族序列的开放阅读框（ORF），新克隆5条基因（Ac-CSP1、Ac-CSP2、Ac-CSP4、Ac-CSP5和Ac-CSP6）的GenBank登录号分别为：FJ157352、FJ157353、JQ979432、JQ979433和JQ979434，开放阅读框分别为351、354、387、315和378bp，分别编码116、117、128、104和125个氨基酸残基，预测蛋白质分子量分别为13.85、13.01、14.61、12.46和14.63kD，等电点分别为4.89、8.86、4.53、9.60和8.71，且均具有4个保守的半胱氨酸残基，均符合昆虫CSPs的一般生化特征。中蜂与意蜂CSPs同源基因家族间具有高达95%~99%的相似性。2、利用real-time PCR技术对中蜂各CSPs序列在中蜂工蜂不同发育历期及不同组织表达特征进行研究，结果显示，Ac-CSP1、2、3、4在卵、幼虫和蛹期几乎不表达，其中Ac-CSP1、2、4在触角中表达量最高，而Ac-CSP3在翅中表达量最高；Ac-CSP5在中蜂各个发育历期的表达量几乎相同；Ac-CSP6蛹期有较高表达，其余时期不表达。与意蜂各基因的表达谱在整体相似的情况下局部又存在着某些差异。3、对中蜂主要化学感受蛋白Ac-CSP1、Ac-CSP2和Ac-CSP4进行了原核表达，三者均为上清表达，通过梯度镍NTA琼脂糖凝胶亲和层析纯化获得目的蛋白。4、纯化后的Ac-CSPs蛋白应用荧光光谱法研究其与配基的结合能力。结果表明：1-NPN与Ac-CSPs的解离常数分别为Ac-CSP11.24μmol/L、Ac-CSP21.25μmol/L、Ac-CSP42.99μmol/L。在23种化学配基的结合实验中，7种配基可将三种蛋白与1-NPN的相对荧光值竞争至50%以下，其中花香物质β-紫罗兰酮具有较强的竞争能力，能够将三种蛋白与1-NPN的相对荧光值竞争至10%以下，并且花香物质3,4-二甲基苯甲醛和水杨酸甲酯也有较好的竞争能力，结合中蜂Ac-CSP1，Ac-CSP2和Ac-CSP4的表达谱特征：在中蜂发育早期（卵、幼虫和蛹）均几乎不表达，推测这三种蛋白可能参与工蜂搜寻蜜粉源的行为，可以作为气味分子的运载体行驶一定的嗅觉功能。